| 研究課題/領域番号 |
19K06671
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| 研究機関 | 愛知医科大学 |
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研究代表者 |
猪子 誠人 愛知医科大学, 医学部, 講師 (30393127)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 細胞間接着 / 上皮分化 / 幹細胞 / 組織構築 |
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| 研究実績の概要 |
近年、Rho-kinase阻害剤やBMP-SMAD阻害剤で、正常上皮幹細胞の培養増殖が可能になりつつある(Mou Hら,Cell Stem Cell. 2016;19:217-231他）。これを応用し、報告者は検体に由来する正常乳腺あるいは正常前立腺上皮幹細胞を分化させる２つの方法を培養皿上で確立した。その正当性は、Δp63α、Axin2、Claudin4などの未分化・分化マーカーで確認した。
報告者は昨年度までに、阻害剤の除去による単層上皮（2D）への分化過程を主に分子形態学的に解析した。具体的には、報告者は上皮分化が表層アクチンによる一過性の細胞収縮を必要とすることを発見した。このことは、アクチン重合剤あるいはその阻害剤によって確認した。同時に、この上皮分化はカルシウムイオンとジアシルグリセロールを必要とすることが、これらの添加実験によって明らかになった。これらを総合すると、ハブとなるのは機械刺激あるいはGPCR活性化型カルシウムチャネルとして注目を集める「TRPCファミリー」にいきつく。そのうち上皮特異的な発現をPublic data (GTEx/Human Protein Atlas)で示すTRPC6に着目し解析を進めた。その結果、TRPC6ノックダウン細胞では上皮分化マーカーであるClaudin4の減少を認めた。逆にTRPC6の強制発現はClaudin4の蛋白レベルでの上昇を認めた。以上のことから、これまで謎の多かった上皮分化には「表層アクチンの収縮とカルシウムイオンの流入が必要」で、その一部はTRPC6で説明できると考えた。
今年度は、この2Dの分子基盤の再現性を、独自に構築した3D上皮分化培養系で確認することができた。マトリゲルの入手が困難になっており、予想以上に時間がかかったが、これらの結果は現在投稿中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
現在上皮分化研究においてはオルガノイドに代表されるようなin vivoに近い階層分化（3D分化）での再現性を問われることが多くなっている。実際の論文投稿にあたっても雑誌編集部より3Dのデータを要求された。現在このような３次元培養はマトリゲルを用いるものが代表的であるが、新型コロナの流行や諸事情でマトリゲルの供給が大幅に遅延しており、既存の実験系での再現性を確認することが困難な状況であった。そのため代替えの方法を確立するのに時間を要した。
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| 今後の研究の推進方策 |
以上の理由から、研究期間の延長を申請し、受理された。
今後は成果を速やかに論文として公表するとともに、マトリゲルが入手出来次第、既存のオルガノイドシステムなどでの現象の再現性も確認する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
論文投稿で雑誌編集部から要求された3Dデータに必要な資材（マトリゲル）が、新型コロナの流行や諸事情で現在入手困難になっており、実験の遅延と残額が生じた。
実際には代替法を開発することで成果を一旦まとめる目処がついた。次年度はこれを速やかに論文として公表するとともに、マトリゲルが入手出来次第、既存のオルガノイドシステムなどでの現象の再現性も確認する。また、当初計画にあった多角的なバックアップ解析を可能な限り進め、遅れを取り戻す。
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