| 研究課題/領域番号 |
19K06685
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| 研究機関 | 地方独立行政法人大阪府立病院機構大阪母子医療センター(研究所) |
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研究代表者 |
吉田 千春 地方独立行政法人大阪府立病院機構大阪母子医療センター(研究所), 病因病態部門, 主任研究員 (60360666)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 核-細胞質輸送 / 脱ユビキチン化 / ノンカノニカル |
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| 研究実績の概要 |
我々は神経管閉鎖時に存在する外胚葉性前駆細胞を同定し、それら細胞群は表皮細胞質へと運命決定された後、アクトミオシンなどの細胞骨格が活性化され弾性率に富んだ表皮組織となることを明らかにした (Kimura-Yoshida et., 2015, 2018)。 これら一連の表皮分化と動態変化に、表皮マスター因子であるGrainyhead-like 3 (Grhl3)遺伝子がそのタンパク局在を核内から細胞質へと移行することで制御されることを明らかにしてきた。しかし、GRHL3因子どのようなメカニズムで核から細胞質へ移行するのかについて全くわかっていない。そこで、本申請課題では、GRHL3因子が核から細胞質へと移行する分子機序の解明を目指して研究を行った。
まず、GRHL3因子がタンパク間相互作用する因子を網羅的な同定を行った。具体的にはGSTとの融合タンパク質を発現させ、グルタチオンカラムに固定し細胞抽出液の中から結合タンパク質を精製し、ゲル電気泳動して得られたバンドを質量分析機で同定した。この結果、脱ユビキチン化酵素の一つであるUSP39因子が同定された。実際USP39ノックダウン細胞では、細胞質におけるGRHL3因子の発現が減弱化し、核に強く発現することがわかった。さらにCRISPR/Cas9システムにより、Usp39遺伝子欠損マウスを作製し、そのホモ欠損マウスにおける表現型解析を行った。結果、Usp39遺伝子欠損マウス胚では、原条形成時期（受精後6.5日目）で重篤な形態異常が見られ、胚性致死となることがわかった。さらに、Usp39因子と細胞質Grhl3因子、さらにnon-canonical Wnt (PCP経路）が発生期において協調的に働くことを示した。これらの結果は、国際雑誌に受理された（Communications Biology, 2022 in press)。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
Usp39遺伝子欠損マウスの作製に成功し、シングルホモ欠損による表現型解析は終了している。また、各因子、シグナルとの遺伝的関与を検証するための、ダブル変異マウスの作製・表現型解析も終了し、これらのデータは国際誌に受理された (Communications Biology, 2022 in press)
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| 今後の研究の推進方策 |
GRHL3タンパクを細胞質に安定的に局在するために必要な因子としてUSP39が働いていることは示唆できたが、一方で分化過程にカノニカル Wnt因子と協調的に働いている核内局在制御因子の候補因子が既に同定されている。そこで、2022年度には核内のGRHL3タンパク局在を制御する因子に対して、研究を進めていく予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
今年度は、GRHL3タンパクが細胞質に局在するために必要な分子について同定、解析を行い、結果USP39分子に関する知見をまとめた。次年度では、GRHL3タンパクが核に局在するために必要な分子の同定、機能解析を行う予定である。
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