| 研究課題/領域番号 |
19K06687
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
橋本 昌和 大阪大学, 生命機能研究科, 准教授 (60580496)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 細胞競合 |
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| 研究実績の概要 |
Tead1 KOモザイク胚のエピブラストにおいて、多能性因子の発現量が低いTead1 KO細胞は野生型細胞によって競合的に排除される。この際排除されるTead1 KO細胞はどのような仕組みで野生型細胞によって認識されるのだろうか？この問いに答えるため、まずは細胞競合（細胞死）を抑制した胚を作成し、通常胚のエピブラストとのあいだで発現量に違いのある遺伝子をRNAシーケンスにより探索することにした。この際、胚全体の約８割の細胞数を占める栄養外胚葉も含めてしまうと、エピブラストにおける発現量の差がマスクされてしまう可能性があったため、まずはエピブラストと原始内胚葉のみ（内部細胞塊）を単離する手法を検討した。これまでに一般的に知られている手法としてimmunosurgery法があるが、これは37℃の血清を含む培養液中で1-2時間ほど処理が必要なため、この処理によって遺伝子発現においてアーティファクトがでる可能性があった。そこでそれを回避するため、短時間で胚全体から内部細胞塊のみを単離する方法を新たに確立した。この方法を用いて、細胞死抑制胚と正常発生胚の内部細胞塊における遺伝子発現を調べた。この結果、正常発生胚ではほとんど発現していない遺伝子の中で細胞死抑制胚で発現が見られるものをスクリーニングすることができた。これらの遺伝子は敗者細胞で特異的に発現している表面抗原であり、細胞競合における細胞間相互作用に関わる分子である可能性がある。そこで、現在これらの上位候補遺伝子についてゲノム編集法によってハイスループットにノックアウトマウスを作成し、エピブラストが正常に形成されるか検証する実験を計画している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
短時間で胚全体から内部細胞塊のみを単離する方法を新たに確立したことで、実験的アーティファクトの少ない内部細胞塊特異的な遺伝子発現プロファイリングが可能になったことでこの研究の基盤技術を構築することができた。この遺伝子発現結果ではCdx2などの栄養外胚葉で特異的に発現する遺伝子はほとんどリード数が検出されなかったことから内部細胞塊特異的なものを見ていると評価できた。
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| 今後の研究の推進方策 |
上述のRNAシーケンスによって得られた上位候補遺伝子についてゲノム編集法によってハイスループットにノックアウトマウスを作成し、エピブラストが正常に形成されるか検証する。
また、Tead1依存的細胞競合を ES細胞を用いたin vitroの実験系で、Tead1 KO ES細胞が野生型ES細胞との共培養において排除され、vivoの状態を模倣できるか検証する。次にゲノムワイドなsiRNAライブラリを用いて、網羅的に遺伝子をノックダウンした状態で、 Tead1 KO ES細胞と野生型 ES細胞のあいだで競合による排除を回避させるような遺伝子（たとえばTead1 KOが敗者であることを表す実態分子；表面抗原など）をスクリーニングし、敗者細胞の認識に関わる分子の同定を目指す。また、この細胞を用いたスクリーニングにより得られた候補遺伝子について、実際にマウスの個体発生において着床前エピブラストの細胞競合に関与するかを検証する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
胚から内部細胞塊を単離する方法は予想よりもはるかに安価で行うことが可能になったため、物品費用を抑えることができた。共同研究の打ち合わせて何度か東京へ出張する予定であったが、 Web通話で対処したことで、旅費を抑えることができた。翌年度に回せる額については、当初予定していなかった１細胞RNAシーケンスなどを行いたいと考えている。
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