研究課題
ゲノム重複に伴う遺伝子進化について解明する為、アフリカツメガエルの倍加遺伝子ペアとネッタイツメガエルの祖先型オーソログについて、発生過程における発現パターンをin situハイブリダイゼーション法を用いて比較解析した。対象遺伝子群としては、比較的限られた組織で発現することが知られているneurogeninファミリー（ngn1, ngn2, ngn3）に注目した。まずngn1に関しては、アフリカツメガエルの倍加コピーの内、すでに１コピーがゲノムから失われており、残る１コピー（ngn1.L）とネッタイツメガエルの祖先型ngn1との間では、感覚器や中枢神経系に限局した発現が保存されていた。ngn2に関しては、アフリカツメガエルの倍加コピーの内の１つ（ngn2.L）と、ネッタイツメガエルの祖先型ngn2との間で、眼や脳での発現が保存されているのに対して、アフリカツメガエルのもう１つのコピー（ngn2.S）は、それらの組織でごく僅かな発現を示すのみであった。ngn3に関しても、アフリカツメガエルの倍加コピーの内の１つ（ngn3.S）と、ネッタイツメガエルの祖先型ngn3との間で、後脳特異的な発現が保存されているのに対して、アフリカツメガエルのもう１つのコピー（ngn3.L）は、その発現がごく僅かなレベルにまで低下していた。これらの結果から、アフリカツメガエルのngn1は既に１コピーに回帰しているのに対し、ngn2とngn3はその途中過程にあると考えられた。この可能性を検討する為、アフリカツメガエルの倍加コピーとネッタイツメガエルの祖先型との間で、アミノ酸配列の比較解析をおこなったところ、発現の低下しているngn2.Sとngn3.Lでは、同義置換に対する非同義置換の割合（dN/dS）が上昇し、二量体形成とDNA結合に必要なbHLHドメインに非同義置換が蓄積していることがわかった。
2: おおむね順調に進展している
本研究で検証する仮説の１つは、「特定の組織に限局して発現する遺伝子は、少ない数のエンハンサーで発現制御されている為、倍加コピーが形成されて純化選択圧が低下すると、エンハンサー変異によって発現を失いやすい。その為に１コピーに回帰しやすい。」というものである。この仮説を検証する為に、感覚器や神経系の一部に限局して発現するneurogeninファミリーについて解析をおこない、予想通り、アフリカツメガエルのngn1は既に１コピーに回帰済みであり、ngn2とngn3においては倍加コピーの片方が発現を失いつつあることを発見した。ngn2とngn3の発現低下は、それらのエンハンサーに変異が蓄積した為である可能性が高い。またアミノ酸配列の比較解析からも、ngn2やngn3は機能を失いつつあることが示唆された。このような「偽遺伝子化」の途中にあるものを同定できたことによって、研究計画通り、ネッタイツメガエルの祖先型ngn2及びngn3との比較シス解析から、エンハンサーの変異の実体を解明するまでの道筋を構築することができた。
次年度以降も、基本的には当初の研究実施計画に従って進める。但し研究実績の概要で述べたように、「偽遺伝子化の途中にある倍加コピー」の典型例として、発現低下のみならず非同義置換を蓄積したngn2.Sとngn3.Lを同定できたことから、まずこれらが果たしてどの程度、生体内での機能を持つのかを明らかにする実験をおこなう。既にRNAインジェクション法による強制発現実験、及びCrispr/Cas9法による遺伝子破壊実験を開始している。その結果、予備的ではあるが、祖先型の発現とアミノ酸配列を維持しているngn2.L及びngn3.Sと比較して、変異蓄積型のngn2.Sとngn3.Lは、生体内での機能を失いつつあることを示唆するデータが得られている。この実験を進めて確実なデータを得ると共に、研究計画書に示した方法を用いて、ネッタイツメガエルの祖先型ngn2及びngn3との比較シス解析を進め、ngn2.Sとngn3.Lの発現低下をもたらしたエンハンサー変異を同定する。また、ngnファミリー以外にも解析対象遺伝子を広げ、「倍加すると１コピーに回帰しやすい遺伝子群」をゲノムワイドに同定し、その特徴の共通性を明らかにする。
（理由）研究結果の概要と今後の推進方策において述べたように、遺伝子発現パターンと非同義置換率の解析の結果から、倍加遺伝子ペアの片方のコピーが偽遺伝子化しつつあることが示唆された。この結果に従い、トランスジェネシスによるエンハンサー解析実験よりも、RNAインジェクション法による強制発現実験とCrispr/Cas9法による遺伝子破壊実験の開始を先行させた為、その差額分の支出が減少した。（使用計画）上記の実験は、いずれも令和元年度から令和２年度にかけて実施予定のものであり、その順序を入れ替えただけである。その為、今回生じた次年度使用額は、令和２年度にトランスジェネシスによるエンハンサー解析実験をおこなう為に用いる。
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Sci. Rep.
巻: 9 ページ: 12560
https://doi.org/10.1038/s41598-019-48979-4
http://amphibian.hiroshima-u.ac.jp/front-page/evo-devo_genomics/
