| 研究課題/領域番号 |
19K06695
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| 研究機関 | 和歌山県立医科大学 |
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研究代表者 |
磯野 協一 和歌山県立医科大学, 共同利用施設, 准教授 (90323435)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 遺伝子発現制御 / ヒストン修飾 / DNA修復 / ES細胞 |
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| 研究実績の概要 |
転写抑制因子ポリコーム群複合体は細胞分化や細胞増殖に関わる多くの遺伝子を安定的に抑制することで幹細胞の分化や自己複製を制御している。最近、申請者はポリコーム群複合体の成分PHC2がDNA損傷誘導的にリン酸化され、幹細胞のDNA修復に貢献する結果を得た。これはポリコーム群が幹細胞の自己複製能、多能性に加え遺伝情報維持にも働いていることを示唆している。本研究では幹細胞ポリコーム群が関わるDNA損傷修復の分子基盤を解明するために次のプロジェクトに着手した。
１．特定された部位でDNA損傷を誘導する系の確立とPHC2の役割解析
以下の結果から、本目的に適した系の確立に成功したと思われる。Phc1/2 二重欠損（dKO）ES細胞をバックボーン細胞とした。当初、Phc1/2 dKO ES細胞のPhc2遺伝子再構築法はランダムゲノム挿入を考えていたが、これは挿入部位による影響を受ける可能性が有り、複数の細胞株を解析する必要があった。そこでCRISPR/Cas9法を取り入れ、ROSA26遺伝子座へのノックインに切り換えた。先行実験として、野生型Phc2による再構築細胞で期待通りの結果を得た。今後、予定通りにPhc2変異型での再構築とそれらを用いた分子解析へと向かう。
２．ポリコーム群によるヒストンH2AXユビキチン化の役割解析
H2AXユビキチン化部位の点変異マウスは一見正常であったため、実験材料であるES細胞に問題が起こるとは思っていなかった。しかしながら、点変異ホモES細胞は増殖不良となり研究利用が難しくなった。したがって、研究計画の見直しが必要となった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
１．特定された部位でDNA損傷を誘導する系の確立とPHC2の役割解析
8塩基対制限酵素(AsiSI)-エストロゲン受容体（ER）融合遺伝子をPhc1/2 dKO ES細胞にゲノム導入した。この細胞（dKO-AsiER）がタモキシフェン添加数日後に全滅することを確認後、強発現プロモーター下のPhc2 cDNAをROSA26領域にノックインした。この再構築細胞（PHC2WT-AsiER）はタモキシフェン存在下でも生き残る集団が発生した（コロニー形成）。これら結果は、PHC2がAsiSI切断（ハプロイド当たりおよそ100箇所）による細胞死をレスキューできることを示している。したがって、PHC2によるDNA修復機構を調査する系が確立できたと考える。
２．ポリコーム群によるヒストンH2AXユビキチン化の役割解析
ポリコーム群はDNA損傷誘導的にH2AX-K118/119をユビキチン化するがその役割は不明である。その解明のためにH2AX-K118/119R変異マウスを作製した。ホモ個体は繁殖性であり、MEFの増殖性も野生型と同等であった。しかしながら、ホモES細胞はH2AX欠損ES細胞のように増殖性が非常に低く一連の解析には適さないと判断した。そこで野生型エクソンとK118/119Rエクソンとの条件的交換法を試みた。しかしゲノム構築には成功したが、タンパク質レベルで期待通りに発現する細胞株を得ることができなかった。H2AX-K118/119は胚発生から生殖までの生理学的現象に不可欠ではないが、ES細胞の維持に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。したがって、DNA損傷応答を対象とする本研究計画は再考される必要がある。
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| 今後の研究の推進方策 |
１．特定された部位でDNA損傷を誘導する系の確立とPHC2の役割解析
予定通りにATMによってリン酸化されるPHC2セリン残基のアラニン置換（SA）とクロマチン凝集に関わるPHC2自己重合部位のアミノ酸置換（LR）をコードするPhc2遺伝子をROSA26へノックインする。dKO-AsiER、PHC2WT-AsiER、PHC2SA-AsiER、PHC2LR-AsiER細胞をタモキシフェン処理し、生存率に違いがあるかを調査する。DNA修復能を評価するために、生き残ったコロニーからDNAを精製、PCR増幅し、AsiSI部位の配列保全性を調べる。DNA修復への分子貢献を調べるために、タモキシフェン添加後にポリコーム群おより修復因子のChIP解析をおこなう。
２．ポリコーム群によるヒストンH2AXユビキチン化の役割解析
ES細胞以外の幹細胞樹立と維持はコスト増加、MEFは細胞老化のデメリットを伴う。課題１は順調であり、本研究の核心であること、加えて予算および時間の制限を考えると、課題１に傾注するのが妥当であると考える。しかしES細胞の維持に不良があることは非常に興味深い表現型であることから、予算・時間の範囲内で推進していくつもりである。まずはRNA-seqおよびChIP-seqにより全体像を捉えたい。
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