| 研究課題/領域番号 |
19K06698
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| 研究機関 | 国立遺伝学研究所 |
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研究代表者 |
河崎 敏広 国立遺伝学研究所, 遺伝形質研究系, 助教 (30770630)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 精子形成 / 精原細胞 / 減数分裂 / ゼブラフィッシュ |
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| 研究実績の概要 |
精子形成では、精原細胞の増殖に伴う成熟と減数分裂のスタートは密接に関係するが、この過程を制御する機構は未解明である。本研究はゼブラフィッシュにおいて、初期精原細胞が成熟できないmoto変異体、成熟を経ずに減数分裂を開始する異常を持つPM-035変異体を用いたトランスレイトーム解析(網羅的な翻訳活性解析)を通して、精原細胞の成熟・減数分裂開始を制御する分子基盤の確立、および制御因子の同定を行うものである。
令和元年度はトランスレイトームを得るのに必要な、初期精原細胞においてGFPタグを持つリボソームタンパク質を発現させるトランスジェニック(sox17:EGFP-rpl10a)を作成し、moto変異体、およびPM-035変異体と掛け合わせ、TRAP法(Translating Ribosome Affinity Purification)を用いて野生型、および両変異体の初期精原細胞のトランスレイトームを得ることを予定していた。しかしながら、受精卵に注入したトランスジーン(sox17:EGFP-rpl10a)がゲノムに挿入されず、トランスジェニックを作成できないトラブルによって計画に遅れが生じてしまった。その後、この原因を解決して野生型のトランスジェニックを得ることに成功し、現在はmoto変異体、およびPM-035変異体との掛け合わせの段階にある。令和２年度中に野生型、moto変異体、PM-035変異体における初期精原細胞のトランスレイトームを得ることを予定している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
概要に述べたように、初期精原細胞のトランスレイトームを得るために必要なトランスジェニック(sox17:EGFP-rpl10a)の作成に問題を抱えたため、計画に遅れが生じてしまった。本研究ではTol2因子を用いたトランスポゾン転移によって効率よくゲノムに挿入する、ゼブラフィッシュでスタンダートとなっている手法を採用した。この手法ではトランスジーンを含むプラスミドと、Tol2因子のmRNAを同時に受精卵に注入するが、本研究で使用したプラスミド抽出キットではRNaseがプラスミド溶液に混入し、Tol2因子のmRNAを分解してしまうことが原因と考えられた。RNaseを使わずにプラスミドを抽出し、PEG沈殿によって混入RNAを除去した後に受精卵に注入することにより、現在では問題なくトランスジェニック個体が得られており、研究の遂行に問題はない。
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| 今後の研究の推進方策 |
現在、野生型でトランスジェニック(sox17:EGFP-rpl10a)を得ることに成功しており、moto変異体、およびPM-035変異体と掛け合わせを行なっている段階にある。今後は掛け合わせを進め、両変異体でトランスジーン(sox17:EGFP-rpl10a)を持つ個体群を作成していく。得られた個体群の精巣からTRAP法を用いて初期精原細胞で翻訳を受けているmRNAを抽出して次世代シーケンス を行い、それぞれのトランスレイトームを取得する。精原細胞が成熟できないmoto変異体-野生型間でトランスレイトームを比較することで精原細胞の成熟に関わるタンパク質群、PM-035変異体-野生型間でトランスレイトームを比較することで減数分裂開始に関わるタンパク質群の候補を得る。ここまでを令和2年度に行い、令和３年度の変異体作成による重要な制御因子の同定につなげる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
令和元年度はTRAP法を用いて初期精原細胞で翻訳を受けているmRNAを抽出し、次世代シーケンス を行う予定であったが、上記の理由で計画に遅れが生じ、TRAP法に用いる試薬、次世代シーケンスにかかる費用を使用しなかったためである。これらの費用は令和２年度で使用する。
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