| 研究課題/領域番号 |
19K06711
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| 研究機関 | 名古屋市立大学 |
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研究代表者 |
湯川 泰 名古屋市立大学, 大学院理学研究科, 教授 (70381902)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 長鎖非コードRNA / シロイヌナズナ / RNAポリメラーゼIII / 感染防御 / ストレス応答 / RNA結合タンパク質 / 種子形成 / サリチル酸 |
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| 研究実績の概要 |
ゲノムからは多様な非コード RNA (ncRNA)が転写される。中でも200 塩基を超える長鎖非コード RNA (long ncRNA, lncRNA)の多くは機能が未解明である。申請者は、植物のRNAポリメラーゼ IIIの転写プロモーターに着目して、アブラナ科植物のシロイヌナズナから興味深い260塩基長のAtR8 lncRNAを発見した。RNAポリメラーゼ IIIはtRNAのようなハウスキーピング遺伝子を転写し、環境ストレスに応答した発現制御をしないと思われているが、AtR8 lncRNAはストレスに応答する特徴があった。さらにAtR8 lncRNA遺伝子変異体を用いたマイクロアレイ解析では、このRNAが感染防御およびストレス応答に強く関与することが示された。
そこで、３つの目的を設定した。【目的1】AtR8 lncRNA結合タンパク質の同定、【目的2】AtR8 lncRNAの種子形成に関わる機能解析、【目的3】AtR8 lncRNA遺伝子のサリチル酸応答メカニズムの解明、である。
【目的1】に関しては、AtR8 lncRNAとタンパク質の複合体を、シロイヌナズナ培養細胞（MM2d株）からの単離精製に技術的目処をつけた。
【目的2】に関して、AtR8 lncRNAが未熟種子にも多量に蓄積することを見出し、in situ ハイブリダイゼーション法により未熟種子における局在を明らかしにした。
【目的3】に関しては、感染防御に関わりの深いWRKY転写因子遺伝子の発現に対してAtR8 lncRNA遺伝子発現が明白な逆相関を示したため、その制御機構について研究を進めた。In vitro転写系を用いた解析の結果、サリチリ酸応答シス配列であるas-1を解した制御が行われていることを示唆する結果を得るに至った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
コロナ禍で研究計画が全体的に遅れたが、最終年度である今年度は【目的1】AtR8 lncRNA結合タンパク質の同定を遂行した。lncRNAに結合するタンパク質を同定する目的で、シロイヌナズナの培養細胞からRNA-タンパク質複合体を精製する方法を確立した。シロイヌナズナは小さな植物で、一般的に生化学的な研究に向かないが、幸いAtR8 lncRNAは培養細胞で高発現する。そこで、増殖速度が比較的良好なMM2d株を用いて、大量培養系を確立した。MM2d細胞はケンブリッジ大学のMurray教授が開発した培養細胞であり、我々は転写の研究のために15年以上維持しており、それを利用した。200グラム程度の培養細胞から開始して、プロトプラスト化した後、パーコールを用いた遠心分離で液胞を除去し、細胞破砕後に硫安沈殿をおこなった。硫安沈殿を溶解後に、ゲルろ過カラム、疎水クロマトグラフィー、ショ糖密度勾配遠心分離、ネーティブPAGEによる複合体精製の条件を固めることができた。複合体を含むフラクションの確認は、RNA抽出後に逆転写リアルタイムPCRを行うことで可能であった。現時点で正確な分子量は不明であるが、CBBで染色可能な量を精製でき、複合体はかなり大きな構造をしていることが判明した。すぐに質量分析が可能なところまで条件を整えることができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
コロナ禍による研究遅延のため延長申請を行っており、【目的1】について残りの予算で速やかに複合体の質量分析(LC-MS/MS)に用いる。結合タンパク質の候補が得られしだい、そのタンパク質の変異体入手、組換えタンパク質の作製、抗体の作製を順次進め、AtR8 lncRNAの機能を解明し、その成果を論文発表する。
【目的2】AtR8 lncRNAの配偶子形成に関わる研究については、成果をまとめ論文発表を進める。
【目的3】AtR8 lncRNA遺伝子のサリチル酸応答機構の解明については、in vitro解析を完了し、引き続き植物培養細胞を使ったin vivo解析によって検証を進め、論文にまとめる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究期間の3年間全体にコロナ禍による影響があり、研究の遅延が生じたために延長申請を行った。残予算はRNA結合タンパク質の同定に速やかに使用することで、当初に掲げた目的を達成できる。また、複数の論文発表を控えており、投稿料としても残予算を使用する。
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