| 研究課題/領域番号 |
19K06711
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| 研究機関 | 名古屋市立大学 |
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研究代表者 |
湯川 泰 名古屋市立大学, 大学院理学研究科, 教授 (70381902)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 長鎖非コードRNA / シロイヌナズナ / RNAポリメラーゼIII / 感染防御 / ストレス応答 / RNA結合タンパク質 / 種子形成 / サリチル酸 |
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| 研究実績の概要 |
ゲノムからは多様な非コードRNA (ncRNA)が転写される。中でも200 塩基を超える長鎖非コード RNA (long ncRNA, lncRNA) の中には細胞の機能と関わった興味深いものがある。申請者は、植物のRNAポリメラーゼ IIIの転写プロモーターに着目して、アブラナ科植物のシロイヌナズナから260塩基長の新規RNAであるAtR8 lncRNAを発見した。RNAポリメラーゼ IIIはtRNAのような細胞機能の根幹をなすRNAを転写するが、環境ストレスに応答した発現制御をしないと思われていた。しかし、AtR8 lncRNAは興味深いことに低酸素ストレスに応答する特徴があった。さらにAtR8 lncRNA遺伝子変異体を用いたマイクロアレイ解析では、このRNAの機能が感染防御およびストレス応答に強く関与することが示された。 そこで、3つの目的を設定した。【目的1】AtR8 lncRNA結合タンパク質の同定、【目的2】AtR8 lncRNAの種子形成に関わる機能解析、【目的3】AtR8 lncRNA遺伝子のサリチル酸応答メカニズムの解明、である。
【目的1】に関しては、AtR8 lncRNAとタンパク質の複合体を、シロイヌナズナ培養細胞(MM2d株)から単離精製した。AtR8 lncRNAの結合タンパク質の一つとしてHSP70タンパク質が同定され、RNAと果たす整理機能について解析を進めた。
【目的2】に関して、AtR8 lncRNAが未熟種子にも多量に蓄積することを見出し、in situ ハイブリダイゼーション法により未熟種子における局在を明らかしにした。
【目的3】に関しては、感染防御に関わりの深いWRKY転写因子遺伝子の発現に対してAtR8 lncRNA遺伝子発現が明白な逆相関を示したため、その制御機構について研究を進めた。In vitro転写系を用いた解析の結果、サリチリ酸応答シス配列であるas-1を解した制御が行われていることを示唆する結果を得た。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
コロナ禍で研究計画が全体的に遅れたが、【目的1】AtR8 lncRNA結合タンパク質を同定まで進めることができた。その際に、シロイヌナナズナの培養細胞からRNA-タンパク質複合体を精製する方法を確立した。シロイヌナズナは小さな植物で、一般的に生化学的な研究に向かないが、幸いAtR8 lncRNAは培養細胞で高発現する。そこで、増殖速度が比較的良好なMM2d株を用いて、大量培養系を確立した。MM2d細胞はケンブリッジ大学の Murray教授が開発した培養細胞であり、我々は転写の研究のために16年以上維持しており、それを利用した。200グラム程度の培養細胞から開始して、プロトプラスト化した後、パーコールを用いた遠心分離で液胞を除去し、細胞破砕後に硫安沈殿をおこなった。硫安沈殿を溶解後に、ゲルろ過カラム、疎水クロマトグラフィー、ショ糖密度勾配遠心分離、ネーティブPAGEによる複合体精製の条件を固めることができた。複合体を含むフラクションの確認は、RNA抽出後に逆転写リアルタイムPCRを行うことで可能であった。CBBで染色可能な量を精製することができ、質量分析を実行でき、51種類の結合蛋白質候補を得た。その中から、MAGOタンパク質とHSP70を選択して、生理学的な解析に着手できた。
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| 今後の研究の推進方策 |
【目的1】である複合体の質量分析(LC-MS/MS)は完了した。結合タンパク質の候補の変異体入手、組換えタンパク質の作製、抗体の作製を順次進め、AtR8 lncRNAの機能を解明する。
【目的2】AtR8 lncRNAの配偶子形成に関わる研究については、研究の区切りつがついているため、成果をまとめ論文発表する。
【目的3】AtR8 lncRNA遺伝子のサリチル酸応答機構の解明については、in vitro解析を完了し、引き続き植物培養細胞を使ったin vivo解析によって検証を進め、論文にまとめる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究期間の3年間全体にコロナ禍による影響があり、研究の遅延が生じたために２年間の延長申請を行った。残予算はRNA結合タンパク質の機能解析に速やかに使用することで、当初に掲げた目的を達成できる。また、複数の論文発表を控えており、投稿料としても残予算を使用する。
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