| 研究課題/領域番号 |
19K06743
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| 研究機関 | 兵庫県立大学 |
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研究代表者 |
峰雪 芳宣 兵庫県立大学, 生命理学研究科, 教授 (30219703)
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| 研究分担者 |
玉置 大介 富山大学, 学術研究部理学系, 助教 (20793053)
中井 朋則 兵庫県立大学, 生命理学研究科, 助教 (60347531)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 分裂準備帯 / 微小管 / PPB / cdk / actin / 核・細胞質相互作用 |
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| 研究実績の概要 |
植物の細胞分裂面挿入位置決定には分裂準備帯（preprophase band, PPB）と呼ばれる微小管が帯状に細胞表層に並ぶ構造が重要な役割をしている。PPBはG2期に幅の広い微小管帯として出現し、微小管帯が狭くなって表層細胞分裂面挿入予定域（CDZ）と呼ばれる幅数マイクロメートルの細胞膜ドメインが完成し、細胞分裂の最後で細胞板の端はCDZに向かって伸張していく。我々はPPBが狭くなる過程に、核からのシグナルが必要な過程が存在すること、またこの時期の微小管の束化にアクチン繊維が関係していることに気づいた。本研究では、核からのシグナルによって誘導されるPPB形成機構を明らかにすることを目的としている。
まず、核からのシグナルの候補として、CDK/cyclinに注目して研究を行ってきた。以前の研究でウエスタンブロットでは、すべての真核生物のcdc２（CDK１, 植物ではCDKAと呼ぶ）が共通に持っているPSTAIR配列を認識するPSTAIR抗体と反応するが、タマネギcdc2 （CDKA1）を特異的に認識するタマネギcdc2抗体とは反応しないバンドの存在が明らかになった。そこで、このバンドの実体解明を目指し、タマネギのRNA-seqのデータ解析を行った。その結果、目的の分子の候補としてCDKB1;1の可能性が出て来たため、タマネギCDKB1;1に特異的な抗体を作製した。また、PPB形成時期のアクチン-微小管相互作用観察のため、我々が以前開発した細胞の表層の細胞骨格の様子の高分解能での撮影と並行して細胞全体の様子も記録できる局所・大局ライブイメージング顕微鏡（global-local live imaging microscope, GLIM）システムを使った解析も開始した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
コロナ騒動で県外への移動とキャンパス内への学生の立ち入に制限があり、学生の研究室内での実験と富山大から県立大のGLIMシステムを使った実験があまり進まなかった。その代わりに、RNA-seqや抗体作製など、外注できるものは外注して研究の遅れを補ったため、２年度目は予定よりもやや進行が遅れた状態で経緯できた。
ウエスタンブロットにおいてPSTAIR抗体で検出できるCDKは何かを調べる研究では、昨年度行ったタマネギ根端におけるRNA-seq以外に、タマネギ実生の他の組織でもRNA-seqを行い、これらのデータを比較解析した。その結果、根端分裂組織で主に発現しているPSTAIR配列を持ったペプチドは以前報告しているCDKA1;1（Accdc２）だけであるが、PSTAIRに似た配列をもちPSTAIR抗体が認識できそうな候補として新たにCDKB1;1が出て来た。現在このCDKB抗体も作製できたので、今後の解析に期待できる。
富山大学で行っているPPB形成過程におけるアクチンと微小管との関係についてのライブイメージング解析は、富山大学での予備実験を終えて兵庫県立大学にあるGLIMシステムを使った観察を開始した。しかし、コロナ騒動で富山大から兵庫県立大に来る機会が少なく、まだあまりデータが撮れていない。そこで、年度末にGLIM２号機を富山大に移設し、富山大学でGLIMシステムを使ったライブイメージングができるよう準備中である。
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| 今後の研究の推進方策 |
PSTAIR配列を持つ植物CDKにはCDKA1（cdc２）とCDKA2が知られている。今回のタマネギのRNA-seq解析ではCDKA2遺伝が存在する証拠は得られなかった。一方、PSTAIR領域のアミノ酸が少し異なっているCDKB1;1が発現していることが分かった。このタマネギCDKB1;1に対するペプチド抗体を作製することができたので、来年度はこの抗体を使ってウエスタンブロットと蛍光抗体法を使った解析を行い、CDKB1;1がPPB形成過程に関与しているかどうか解析する予定である。
PPB形成過程のアクチンと微小管との関係については、以前我々はタマネギを使ってアクチン繊維が隣あう微小管を束ねていると思われる過程を電子顕微鏡レベルで報告したが、ライブイメージングでそれをサポートするデータはなかった。そのため、タバコの培養細胞を使ってPPB形成過程における微小管とアクチン繊維の関係を調べる予定である。３月に富山大学にGLIMシステムを移管し、コロナで移動が制限されても富山大学内でGLIMシステムを使ったライブイメージング撮影が可能になったので、GLIMシステムを使って核の状態を見ながら細胞表層の微小管やアクチンなどの分子の挙動の観察をし、PPB形成過程における微小管とアクチン繊維の挙動について解析する予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
コロナ騒動で、学会発表などに使用予定の旅費などが使用できなかった。ただ、その一部はRNA-seq解析と抗体作製の費用に使用したが、今年度中に使用できなかった。この３月にGLIMシステムを富山大学に移動したので、富山大学でGLIMシステムを使った解析に必要な消耗品と旅費に使用予定である。
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