| 研究課題/領域番号 |
19K06744
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| 研究機関 | 城西大学 |
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研究代表者 |
佐野 香織 城西大学, 理学部, 助教 (70612092)
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| 研究分担者 |
神田 真司 東京大学, 大気海洋研究所, 准教授 (50634284)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 魚類卵膜 / 発現場所の変化 / 組換えタンパク質作製 |
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| 研究実績の概要 |
魚類の卵膜は元来卵細胞が合成していたが、その進化過程で合成場所が肝臓へと移行した。このようなダイナミックな変化を遂げるには、発現場所の変化、肝臓から卵巣への輸送の仕組み、他器官から運ばれてきたタンパク質で卵膜を形成など、多くの変化を伴うことが予想される。これを検証するためにはまだ解明されていない、魚類の卵膜形成メカニズムを理解する必要がある。本研究は、魚類の進化において卵膜の合成場所が変化した要因を探るため、卵膜タンパク質を合成するゼブラフィッシュと肝臓で合成するメダカを研究材料として、トランスジェニック生物および卵膜タンパク質を用いた解析によってこれらの卵膜形成メカニズムとその違いを明らかにすることを目指している。
本年度は、哺乳類細胞HEK293細胞による発現系によって、メダカ及びゼブラフィッシュの卵膜タンパク質を作製した。western blottingなどによる解析の結果、本来の卵膜タンパク質と同じサイズの糖鎖が付加した組換え卵膜タンパク質の作製に成功した。また、FLAGタグをつけた組換え卵膜タンパク質も作製した。現在、生体に投与して解析中である。
また、FLAGタグ付きの卵膜タンパク質を肝臓で発現するトランスジェニックメダカを作製し、卵巣を解析したところ、組換え卵膜タンパク質を卵膜で検出することができた。現在、本来卵細胞で卵膜タンパク質を合成するゼブラフィッシュにおいて、肝臓で合成させるようなトランスジェニックを作製し、現在飼育中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
HEK293を用いて、糖鎖が付加した卵膜タンパク質が作製する手法を確立できた。同様の方法で、蛍光タンパク質と融合した卵膜タンパク質などを今後作製できる見通しが立った。
また、解析のためにFLAGタグをつけた卵膜タンパク質を発現するトランスジェニックメダカを作製し、そのタンパク質が卵膜として検出することができた。このことから、タグの位置や種類を決定することができた。ゼブラフィッシュの卵膜タンパク質を肝臓で発現させるトランスジェニックにおいても、この点は妥当であることを示せたと考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
組換え卵膜タンパク質を生体に投与してその挙動を解析することによって、卵細胞で合成される卵膜タンパク質と肝臓で合成される卵膜タンパク質の、卵膜形成機構の違いを明らかにしてゆきたい。
また、組換え卵膜タンパク質が単離培養した卵巣で卵膜を形成できるかを解析する。その後、蛍光タンパク質と融合した組換え卵膜タンパク質を作製して、単離培養卵巣における卵膜形成過程をFRETを用いたリアルタイムイメージングで解析することを目指している。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度は培養細胞による組換えタンパク質作製法の確率、及び、マイクロインジェクションによるトランスジェニックの作製が中心だったため、分子生物学の試薬・消耗品でのみ実験できたため。予定の半分程度の支出に収まった。
来年度以降は、FRET解析等に進めればリアルタイム観察に用いる顕微鏡に不足しているフィルターなどの備品を追加予定である。
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