| 研究課題/領域番号 |
19K06747
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| 研究機関 | 昭和大学 |
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研究代表者 |
三田 雅敏 昭和大学, 医学部, 客員教授 (50190674)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 生殖制御機構 / リラキシン様生殖腺刺激ペプチド / Gタンパク質共役受容体 / 免疫組織化学 / ヒトデ |
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| 研究実績の概要 |
無脊椎動物の生殖制御機構を分子レベルで解明することを目的として、本研究では、ヒトデのゴナドトロピン様活性物質、リラキシン様生殖腺刺激ペプチド (relaxin-like gonad-stimulating peptide, RGP)に注目し、(1) RGPとその受容体との相互作用、および (2) 放卵（放精）のメカニズムについて解析をおこなった。
(1) RGPとその受容体との相互作用： アカヒトデ、エゾヒトデ、ヤツデヒトデ、モミジガイについてRNA-seq解析をおこない、これら4種のRGPのcDNA情報を公開した。また、オニヒトデ(Acanthaster planci)のRGPは、既に同定していたが、最近、オニヒトデは4種類に分類されたことから、今回、Acanthaster cf. solarisのRGPを新たに同定した。オニヒトデRGP (AsoRGP)はイトマキヒトデRGP (PpeRGP)と一部アミノ酸配列が異なっていたが、放卵アッセイによれば、AsoRGPとPpeRGPには種特異性はみられず、AsoRGPとPpeRGPは互いにそれぞれの受容体と反応することが強く示唆された。
(2) 放卵（放精）のメカニズム： RGPは主に放射神経から存在することが知られている。PpeRGP抗体はAsoRGPに対して、PpeRGPとほぼ同様な力価を示した。そこでPpeRGP抗体を用いて、オニヒトデ放射神経内のAsoRGPの分布を免疫組織化学的手法により観察した。その結果、AsoRGPはオニヒトデ放射神経内部の神経線維の多い領域に分布していることが明らかになった。このことから、RGPは放射神経周辺の細胞で合成された後、神経線維の多い中心部に貯蔵され、繁殖期になるとRGPは放射神経から体腔側の血洞系に分泌され、血洞系を通って生殖巣まで運ばれ、卵巣や精巣を刺激すると考えられる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
(1) RGPとその受容体との相互作用： イトマキヒトデ（アカヒトデ目）のRGP受容体は同定できたが、予定していたオニヒトデ（アカヒトデ目）とAsterias rubens（マヒトデ目）のRGP受容体はまだ未同定である。理由は、COVID-19の感染拡大の影響を受け、東京に緊急事態宣言が出され、あるいは蔓延防止等重点措置期間にあったことから、繁殖期にオニヒトデおよびA. rubensの生息する採集現場に行けず、サンプル調製や放卵アッセイなどをおこなうことができなかったのが最大の理由である。特に海外出張を予定していた英国のQueen Mary University of Londonがロックダウンになったこともあり、A. rubensを用いる実験は全く進まなかった。
(2) 放卵（放精）のメカニズム： PpeRGP抗体を使ってオニヒトデの放射神経におけるAsoRGPの分布を免疫組織化学的手法により明らかにすることはできた。しかし、COVID-19の感染拡大の影響で、現地での実験を予定していたQueen Mary University of London（英国）を始め、お茶の水女子大湾岸生物教育研究センター（千葉県館山市）や東北大学大学院生命科学研究科附属浅虫海洋生物学教育研究センター（青森県青森市）に出張することができなかった。そのため、A. rubensやマヒトデの放射神経を使う免疫染色やモミジガイの放卵アッセイなどができず、予定していた成果は得られなかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
(1) RGPとその受容体との相互作用： 既に、イトマキヒトデのPpeRGP受容体は同定した。一方、RGPには部分的な種特異性がみられることから、これを解明するために他種のヒトデ (具体的に、Asterias rubens、オニヒトデ)についてRGP受容体を同定し、それぞれのRGPとの相互作用について解析する。方法として、A. rubensとオニヒトデからPpeRGP受容体とホモロジーの高い遺伝子を検索した後、それぞれRGP受容体候補遺伝子をレポータ-遺伝子を持つベクターに組み込み、HEK培養系細胞で発現させ、そこにRGPを加え、HEK細胞内のサイクリックAMP濃度の変動を確認することで同定する。さらに、各RGP分子と受容体との相互作用を解析する。一方、モミジガイ(Astropecten scoparius)のRGPはB鎖のC末がアミド化されている可能性がある。そこで、モミジガイの放射神経抽出液に含まれるAscRGPをLC-MS/MS分析し、アミド化の有無を解明する。次に、アミド化および非アミド化のAscRGPを化学合成し、モミジガイの卵巣に対する放卵アッセイを行い、アミド化による放卵活性への影響を調べる。
(2) 放卵（放精）のメカニズム： 放卵・放精の最初の引き金はRGPの分泌である。イトマキヒトデ（アカヒトデ目）やA. rubens（マヒトデ目）は雌雄異体であり、卵や精子はメスとオスの背側に5箇所ある生殖孔から放出される。生殖巣から生殖孔を繋ぐゴノダクトは繁殖期に伴い発達してくることから、ゴノダクトあるいは生殖孔周辺にRGPが出現してくる可能性がある。PpeRGP抗体とAruRGP抗体は作製済みであることから、イトマキヒトデとA. rubensについて、繁殖期前後および放卵（精）中のゴノダクトや生殖孔周辺のRGPの分布を免疫組織化学的手法により観察する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
2021年度に予定していたMaurice R. Elphich教授(Queen Mary University of London, England)との海外共同研究、東北大学大学院生命科学研究附属浅虫海洋生物学教育研究センターや金沢大学環日本海域環境研究センター臨海実験施設で予定していた実験動物の採集や実験がCOVID-19の感染拡大の影響で実施できなかった。また研究発表を予定していた学術集会がオンラインで開催されたことにより、当初予定していた支出額よりも少なくなった。2022年度の国内外の旅費、物品費および論文掲載費として使用する予定である。
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