研究課題
マウス８日胚のノードには、回転性の運動を行い流れを作り出す動繊毛とノード周縁部に局在する不動繊毛とが存在する。不動繊毛は、動繊毛により作り出された流れを感知することで左右の決定において必須の役割を果たす。このとき、不動繊毛を通じて、細胞外から繊毛内へとカルシウムが流入すると推測されていたが、マウスノードの胚性繊毛において、繊毛からのカルシウムの流入を明確に可視化した研究はなく、その機能も明確ではなかった。本研究では、これら体の左右決定に関わるノードの不動繊毛におけるカルシウム動態を可視化し、左右非対称な繊毛カルシウムシグナルが存在することを明確にすることを目指す。さらに繊毛特異的にカルシウム吸収タンパク質の発現による繊毛カルシウムシグナルの阻害を試みた。これまでの研究により、マウスノード繊毛、および細胞質で激しいカルシウム濃度の振動が存在すること、その振動数は左側で特に高くなっており、左右決定との関わりが強く示唆された。しかし、細胞体から繊毛内へのカルシウムの流入が無視できない程度存在していた。そこで、細胞体でのカルシウムシグナルをThapsigargin処理によって停止させたところ、細胞体ではなく繊毛でのみ上昇する特異的なカルシウム濃度変化が検出された。この繊毛特異的シグナルは顕著な左右での違いを示した。繊毛特異的なシグナルをカルシウム吸収タンパク質の阻害したところ、左右非対称なノーダルシグナルの決定に影響が生じることが明らかとなり、繊毛におけるカルシウムシグナルの重要性が示唆された。さらに、様々な薬剤によりカルシウム阻害を試みることにより、ノード周辺における左右決定において小胞体からのIP3経路を介したカルシウム放出が重要であることが示唆され、繊毛からのイオン流入と細胞体でのカルシウム振動が密接に関連することが明らかとなった。
1: 当初の計画以上に進展している
これまでに、我々はマウスのノードクラウン細胞繊毛特異的にカルシウムセンサータンパク質GCaMP6、ノードクラウン細胞の細胞質においてRGECO1を発現させ、解析を行った。その結果、クラウン細胞の細胞質、繊毛ともに、活発なカルシウム濃度の振動を示し、右側と比べて、左側で有意に高い振動数を示すことが明らかとなった。一方で、細胞質でのカルシウムが、繊毛へと流入しうることが確認され、繊毛由来のカルシウムと細胞体から繊毛へと流入するカルシウム濃度上昇を区別できないという問題が生じた。そこで、繊毛特異的なカルシウム上昇を観察することを目的として、Thapsigargin処理にヨテ細胞質におけるカルシウム濃度変動を抑制した条件で観察した。その結果、ノードの左側繊毛特異的なカルシウム変動の存在が示され、繊毛由来のカルシウム流入の存在が支持された。これらのカルシウムシグナルを示す細胞は、ノードのクラウン細胞の中でも左側に位置する、左右対称性の破れに関与する最初期のシグナルであるNodalアンタゴニストCerl2のmRNA分解を最初に示し、左右非対称なSmadリン酸化を示す細胞と一致していた。さらに、繊毛特異的にカルシウムシグナルを阻害することを目的として、繊毛ターゲティング配列を連結したカルシウムシンクタンパク質を繊毛に強制的に局在させた。このトランスジーンを発現するマウスでは、Cerl2のmRNA分解が、繊毛特異的カルシウム阻害により影響されることが示唆された。これらの知見から、胚における対称性の破れに対して、カルシウムが重要な役割を有することが強く示された。繊毛および細胞質両方の部位におけるカルシウムシグナルが左右決定において重要な役割を果たすと考えられる。以上の知見を、Science Advances 誌に論文として報告した。
繊毛が流れから受容する刺激が化学刺激であるか、物理刺激であるか、という問題への解決は未だ得られていない。それらを解決するための実験を行っている。現在、共同研究者による光ピンセットを用いた実験によって、非常に有望な結果が得られつつある。また、カルシウム流入に関わるチャネルの実体をより明確化する必要がある。以前から信じられているようにPkd2チャネルなどのTRPを由来とするカルシウム流入がある可能性のほか、Pkd2やTRPと共役する別のチャネルを介して、繊毛内部へとカルシウムが流入する可能性も考えられる。これらの経路が存在するかを、遺伝学的解析、薬剤実験とカルシウムシグナルの観察を通して明らかにしていく。また、繊毛におけるカルシウムシグナルと細胞質内でのCerl2 mRNA分解の機構の関連も明らかにする。繊毛の根本が、細胞体と繊毛をつなぐ「特異点」として非常に重要な機能を有することが想像され、実際にCerl2 のmRNAが局在し、小胞体由来のカルシウム上昇が生じる部位は繊毛の根本である。繊毛から何らかの形でシグナルが細胞質に伝わり、細胞質アピカル面において誘起されたカルシウムシグナルによってmRNA分解の機構が開始されると考えられるが、その詳細な機構は不明である。現在、mRNA分解の機構解明の研究は我々のグループで行われており、論文出版予定である。その仕組みとの関連を変異体におけるカルシウムイメージングなどを利用して解明していく。
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すべて 国際共同研究 (1件) 雑誌論文 (2件) (うち国際共著 2件、 査読あり 2件、 オープンアクセス 2件) 学会発表 (1件)
Nature Communications
巻: 11 ページ: 5520
10.1038/s41467-020-19113-0
Science Advances
巻: 6 ページ: eaba1195
10.1126/sciadv.aba1195
