2019 年度実施状況報告書

線虫の体壁筋弛緩によって誘導される咽頭運動停止の機構解明

研究課題

研究課題/領域番号	19K06761
研究機関	名古屋大学
研究代表者	高木新名古屋大学, 理学研究科, 准教授 (90171420)
研究期間 (年度)	2019-04-01 – 2022-03-31
キーワード	摂食運動 / 体壁筋 / 光遺伝学 / C. elegans / 神経ペプチド
研究実績の概要	本研究では、線虫C. elegans体壁筋の活動鎮静化によって咽頭（摂食器官）のポンピング運動が停止する、という現象の機構解明を目的として、ポンピング停止シグナルの、(1)受容機構の解明と受容器細胞の特定、(2)内分泌的制御に関わる細胞と物質の特定を行う。　本年度は以下の結果を得た。 (0)光作動性アニオンチャネルARC-2を用いた線虫C. elegans体壁筋の活動鎮静化によるポンピング停止について、各種変異体背景での実験を行ったところ、ポンピング阻害がunc-31変異に影響されないという予想外の結果が得られた。この系統ではArchを用いた体壁筋鎮静化とは異なる機構でポンピング停止が起きている可能性が高いことが明らかになった。 (1)シグナル受容に関わると期待される候補遺伝子（trp-2, met-3, mec-10, trp-1, unc-8, trp-4, osm-9, trp-1 trp-2, trpa-1）各変異をncIs53(myo-3p::Arch::GFP)系統に導入して解析を行った。 (2)多くのペプチドホルモン産生に必要であるproprotein convertaseをコードするegl-3のnull 変異によって、“遅い”ポンピング阻害が消失することを確認した。・当初の計画では神経系のRNAiのためにsid-1遺伝子を異所発現するトランスジェニック系統　uIs60[unc-119p::sid-1]を利用することを予定していた。しかしuIs60をncIs53に導入してunc-31によるfeeding RNAiを行ったが、運動異常（Unc）表現型が観察されず、また神経系で発現するmCherryに対するRNAiでも蛍光がほとんど低下しなかった。そこで、RNAiに対する感受性を向上させる　eri-1; lin-15b　二重変異をncIs53に導入した系統を作成した。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 3: やや遅れている理由 (0)当初、光作動性アニオンチャネルARC-2を用いた実験を予定していたが、ポンピングに対する作用機序がArchと異なるため使用できないことが明らかになった。Archを用いた実験では適当な実験条件範囲が狭まるため、実験の難度が増した。 (1)受容機構の解析において、候補遺伝子の単独変異では影響がないことが明らかになった。 (2)・以前の研究において、私たちは、dense core vesicleからのアミンおよびペプチド放出に必要なUNC-31/CADPS が“遅い”ポンピング阻害に関わることを示した。さらに、カテコールアミン産生・機能に関わる変異はポンピング阻害に影響を与えなかったことから、“遅い”ポンピング阻害にペプチドが関与すると予想した。しかし、その一方で、以前の実験では、多くのペプチドホルモンの産生に必要であるproprotein convertase をコードするegl-3の変異n729がポンピング阻害に影響しないという、私たちの仮説と一見適合しない結果も得ていた。今回egl-3(gk238)によってunc-31同様の効果が見られたことから、“遅い”ポンピング阻害に生体アミンではなくペプチドが関与することが裏付けられた。・eri-1; lin-15b　二重変異をncIs53に導入した系統を作成したところ、独立した3系統を作成したが、いずれにおいても特に成虫でのArch::GFPの発現が顕著に減少しており、従来の照射条件下では緑色光による体壁筋弛緩が引き起こせなかった。　eri-1; lin-15b　をアウトクロスによって除くとGFP蛍光も体壁筋弛緩反応も正常に回復したため、eri-1; lin-15b　変異にトランスジーン発現抑制効果があると考えられる。
今後の研究の推進方策	(0)ARC-2の代わりに、従来のArchを用いた体壁筋鎮静化実験系を用いてポンピング阻害に関与するペプチド、受容体の特定を進めることとする。 (1)これまで調べたいずれの遺伝子変異も単独では顕著な効果がなかったことから、多重変異作成を計画している。　また、感覚繊毛形成に必要な一般的な遺伝子（che-3など）の変異を用いることも検討している。 (2)eri-1; lin-15b変異にトランスジーン発現抑制効果があると考えられるため、この系統にさらに遺伝学な手法でに改良を加えることは難しい。この系統を利用して実験を行える条件を探る必要がある。現在、GFP発現減少が比較的少ない幼虫期(L3)の虫を対象にして照射条件を検討している。必要ならeri-1; lin-15b変異以外のRNAi感受性変異（rrf-3 など）の利用も検討する。
次年度使用額が生じた理由	実験計画の変更にともない一部消耗品の購入が遅れた。　本年度に消耗品として使用予定。