哺乳類の概日リズムにおける時計遺伝子転写振動の役割に関する研究

2020 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 19K06769
• 研究機関: 山口大学
• 研究代表者: 明石 真 山口大学, 時間学研究所, 教授 (30398119)
• 研究期間 (年度): 2019-04-01 – 2022-03-31
• キーワード: 概日時計 / 概日リズム / 時計遺伝子

研究実績の概要

前年度は、マウス株化繊維芽細胞を用いて、抑制型時計遺伝子（Cry1およびCry2）の概日転写調節シスエレメントの破壊を実施した。想定通り、これらの遺伝子の転写振動は消失あるいは顕著に減衰した。従来の分子モデルのように抑制型時計遺伝子の転写振動が概日リズム発現に必須ならば、他の時計遺伝子群の発現リズムも大きく減衰するはずである。しかしながら、一部の時計遺伝子の転写振動はほとんど減衰しなかったことから、概日時計は少なくとも部分的には機能を維持しており、抑制型時計遺伝子の細胞自律的転写振動は概日リズム発生において不可欠ではないことが示唆された。
この結果に基づき、本年度は個体レベルの概日リズム発現において、抑制型時計遺伝子の細胞自律的転写振動の役割を調べることにした。この目的のために、受精卵へのゲノム編集コンポーネントの注入によって、Cry1またはCry2の概日転写において必須のシスエレメントが破壊されたマウスを作成した。オフターゲット効果を考慮して複数のマウスラインを確立し、さらに、両者の交配によってCry1およびCry2遺伝子の両方のシスエレメントが破壊された二重変異体も作成した。
前年度の結果は株化細胞を用いて得られたものであるが、株化細胞は生体の細胞とは異なった形質を持つ可能性がある。そこで、前年度の再現性を確認するために、作成したマウスの胎児より胚性繊維芽細胞を複数ライン樹立し、タイムコースサンプリングによって概日転写振動を調べた。すると、前年度の結果と同様、Cry遺伝子の細胞自律的転写振動が失われると、Per遺伝子の転写振動も消失したが、興味深いことに、一部の時計遺伝子の細胞自律的転写振動は維持されていた。したがって、Cryのみならず、Perの細胞自律的転写振動が失われても、細胞自律的な概日リズムは消失しなかった。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

研究自体は当初の計画通りに進んでおり、研究の遂行を妨げるような特別な問題などは発生していない。しかしながら、解析に必要なサンプル数などが想定を超えて増加しているなどの理由のため、進捗は当初の計画よりも若干遅れている。

今後の研究の推進方策

上述のマウスを用いて、行動生理機能における概日リズムへの影響を調べる。この際、オフターゲット効果などによる影響が出現する可能性も考えて、複数のマウスラインで比較する。第一に、自発行動量の概日リズムを調べる。外的時間情報から遮断された箱の中で単独飼育して、約１週間にわたる馴化を経て、恒常暗条件下において3週間以上にわたって自発行動量を測定する。得られたデータに対して周期および振幅解析を実施する。さらに、心拍数・呼吸数・体温などの概日リズムへの影響も調べるために、テレメトリーセンサーをマウス体内に留置して、上記と同様な飼育環境において測定する予定である。もしもこれらの概日リズムが消失しなければ、抑制型時計遺伝子群の細胞自律的転写振動は個体の概日リズム発生に必須ではないと結論付けられる。
次に、このマウスを用いて、組織自律レベルにおいて時計遺伝子の概日転写を検討する。具体的には、時計遺伝子発現をルシフェラーゼ発光によってリアルタイムモニターできるマウスとの交配を実施して、得られたマウスの肝臓などの組織を体外培養することにより、自律的な概日リズムを評価する。概日リズム中枢である視床下部視交叉上核に対しても実施する。
ところで、ここまで、分子レベルにおいて、転写レベルの変化のみに注目して詳細な解析を行ってきた。そこで本年度は、タンパク質レベルでの解析についても試みる。具体的には、細胞自律的条件下において時計タンパク質の概日リズム解析を実施する。抑制型時計遺伝子において、細胞自律的条件下において転写の概日リズムが失われていても、タンパク質量では概日リズムが維持されている可能性が残されており、これにより細胞自律的な概日リズムが駆動されているのかもしれない。タンパク質量の概日リズムが検出された場合は、この概日リズム発生におけるタンパク質分解系の関与を調べる。

次年度使用額が生じた理由

初年度や前年度の研究計画の実施において想定以上に多くの分析サンプルが発生したため、年度内に全サンプルの解析が終了していない。次年度使用額はこの未分析サンプルの処理に使用することとなる。