| 研究課題/領域番号 |
19K06776
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| 研究機関 | 公益財団法人サントリー生命科学財団 |
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研究代表者 |
酒井 翼 公益財団法人サントリー生命科学財団, 生物有機科学研究所・統合生体分子機能研究部, 研究員 (40414122)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | RNA / antisense / gonad / follicles / gonad |
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| 研究実績の概要 |
本研究課題では、カタユウレイボヤ(Ciona intestinalis typeA)のプロテアーゼ遺伝子関連アンチセンスRNAであるCiChuarpの翻訳産物としてコーディングが推測されるペプチド、Ci-CHUARPの同定とその機能解明を目指している。
（１）免疫沈降による高効率Ci-CHUARP精製達成のため、Ci-CHUARPの４部位（N末端２部位、中央部、C末端）に対して、それぞれの抗体 (抗Ci-CHUARP-N末１、-N末２、-Mid、-C末抗体) を作製した。そして、ウェスタンブロッティング(WB)解析で、ホヤ卵胞抽出溶液における4抗体の特異性を確認した所、抗Mid抗体以外の抗N末１、N末２、C末抗体の3抗体はCi-CHUARP推定分子量（約6kDa）に陽性バンドを示さないことから、今後の解析に利用できないことが判明した。
(２) Ci-CHUARP同定のため、今期は約300匹分の成体ホヤ卵巣から積層ふるいで卵胞サンプリングを行った。次に卵黄形成期卵胞の破砕液を細胞質と膜画分に分画し、その後、SEP-PAK C18カートリッジでペプチド成分を精製した。更に抗CHUARP-Mid抗体ビーズで免疫沈降した細胞質由来分子のSDS-PAGE約6kDaバンドのnanoLC-MS/MS解析を実施したが、Ci-CHUARPは同定されなかった。
（３）カタユウレイボヤ受精卵と胚におけるCiCtshとCiChuarpの発現について、筑波大学笹倉先生にwholemount in situ hybridization (WISH)を実施して頂き、胚発生におけるCiChuarp発現を見出した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
今期の取り組みで、ホヤ卵巣から卵黄形成期卵胞を選別する方法、SEP-PAK精製、そして免疫沈降によるアフィニティー精製について、これらCi-CHUARP同定に必要となる技術の肝となる知見を得る事が出来た。特に、WBで16kDa以上のホヤ卵胞分子と抗CHUARP-Mid抗体との非特異的反応が示されたため、今後の卵胞抽出液のペプチド精製では、非特異的反応分子を排除するため、サンプルのゲルろ過HPLC分画が必要であることを明らかにしたことは大きな成果である。
更に、精製やMS 解析の条件を最適化するための標準物質として、Ci-CHUARPのペプチド合成を行い、合成ペプチドとホヤ卵胞抽出液に対するWBで、抗CHUARP-Mid抗体の特異的認識が示され、これまでCHUARPと推定して来た分子と合成ペプチドの同一分子量が示された意義は大きい。今後は、抗CHUARP-Midを鍵ツールとして、Ci-CHUARP同定と発現解析に取り組む基盤を獲得した。
これまでに、筑波大学笹倉先生の指導の下、CiChuarpノックアウトによるカタユウレイボヤ胚発生への影響を予備実験で観察しており、今期WISHで胚発生においてCiChuarpの発現が確認されたことにより、当該時期におけるCiChurapの役割が考えられた。
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| 今後の研究の推進方策 |
（１）今後の卵胞抽出液のペプチド精製では、卵胞細胞質及び膜画分をSep-Pak処理後、WBで確認された16kDa以上の抗CHUARP-Mid抗体との非特異的反応分子を排除するため、サンプルのゲルろ過HPLC分画を実施する。そして、免疫沈降後にSDS-PAGE約6kDaのバンドのIn gel digestion産物をMALDI-TOF-MS/MS解析もしくは nanoLC-MS/MS解析を実施し、Ci-CHUARPを同定する。
（２）CiCtsh とCiChuarpのRNA発現様態を明らかにするため、卵巣切片、受精卵、そして胚発生におけるin situ hybridization解析を行う。また、CiChuarp の転写・翻訳調節等を明らかにするために、ホヤ組織 RNA からCiChuarp RNAの全長塩基配列をRACE 法で決定する。
（３）抗CHUARP-Mid抗体による免疫組織化学によって卵巣切片、受精卵、そして胚発生におけるCi-CHUARP の局在を明らかにし、RNA発現様態と統合し、生理機能推定に必要な知見を得る。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
令和2年度に実施を計画していた実験がコロナウィルス対策による在宅勤務によって実行出来なくなったことや、学会発表及び実験のための出張による旅費の使用が無く、次年度使用額が生じた。次年度は、この計画していた実験を行うため、実験試薬等を購入する。
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