| 研究課題/領域番号 |
19K06779
|
|---|
| 研究機関 | 名古屋大学 |
|---|
研究代表者 |
青木 摂之 名古屋大学, 情報学研究科, 准教授 (30283469)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
|
| キーワード | 二成分制御系 / ヒメツリガネゴケ / ヒスチジンキナーゼ / ヒスチジン含有リン酸転移因子 / 進化 |
|---|
| 研究実績の概要 |
1）コケのPASヒスチジンキナーゼ1/2（PHK1/2）について次の成果を得た。
1.1）酵母２ハイブリッド系（Y2H）による相互作用解析：Y2Hにより、PHK1/2がヒスチジン含有リン酸転移因子（HPt）の１つHPt2と結合することに加え、PHK1とPHK2が結合すること、そしてPHK2とHPt3も弱く結合することを確認した。さらにHPt2がコケのResponse Regulator（RR）の１つ（PpRR1a）と結合することを確認した。
1.2）PHK1/2とHPt1/2/3の細胞内局在：シロイヌナズナのプロトプラスト内でPHK1/2とHPt1/2/3のそれぞれとEGFPの融合タンパク質を一過的に発現させ、細胞内局在を観察した結果、PHK1、HPt1/2は細胞質に、PHK2とHPt3は核に局在することを確認した。
1.3）二分子蛍光補完法（BiFC）による植物細胞内での相互作用解析：シロイヌナズナのプロトプラスト内で、YFPのN末配列またはC末配列と上記タンパク質との融合タンパク質を様々な組み合わせで一過的に発現させ、蛍光顕微鏡観察を行った結果、PHK1とHPt2は細胞質で、またPHK1とHPt1は核で結合することが確認された。
1.4）下流遺伝子の同定：PHK1/2の遺伝子破壊株を用いてqPCRによる発現解析を行い、PHK1/2の下流遺伝子として、糖代謝関連のHxk1B, SNF1, Pgm1などが同定された。
2）成果の意義・重要性について：詳細なY2H解析とBiFCによりPHK1/2の相棒因子群が解明されたことは意義深い。特に下流因子としてPpRR1a やHxk1Bなどが同定されたことで、PHK1/2が制御する生理的応答について有用な指針が得られた。また細胞内局在の観察結果も明確で、今後の詳細な機能解析・生理実験のうえで基盤的な知見となる。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
１）PHK1/2に始まる二成分制御系（PHK1/2-TCS）の同定について：詳細なY2HとBiFCにより、PHK1/2-HPt2-PpRR1aを、同一環境刺激に関するシグナル伝達・生理応答を請け負う二成分制御系として同定したことは満足すべき結果と考えている。ただし、BiFCはシロイヌナズナ細胞中での観察は終えたが、今後、コケのプロトプラストあるいは原糸体細胞を用いた観察を行う必要があり、現在その準備中である。
２）PHK1/2-TCSの下流遺伝子の同定について：遺伝子破壊株を用いた発現解析により、Hxk1B, SNF1, Pgm1などの糖代謝関連遺伝子を下流遺伝子として同定した点は評価できる。ただしHxk1BとSNF1については再現性にやや難があり、今後条件検討をしたうえで統計的に十分な質・量のデータを取得・解析する必要がある。
３）サイトカイニン・シグナル伝達系とのクロストークについて：サイトカイニン・シグナル伝達系下流遺伝子の発現をサイトカイニン存在下および非存在下で調べるための培養条件・サイトカイニン投与条件の検討を行った。PHK1/2-TCS因子とサイトカイニン・シグナル伝達系で働くTCS因子との相互作用の調査については条件検討中である。
４）ゲノム比較に基づくPHK1/2-TCSの進化解明について： HPtとRRについて、広範な陸上植物とシャジクモ類の間でのオルソログ関係を解析しつつあり、今後、より詳細な系統解析を行ううえでの基礎データが取得されている点は評価できる。
以上、３）のサイトカイニンに関する解析が遅れてはいるが、１）と２）のシグナル伝達系構成因子の同定については研究を実質的に進展させることができており、今後、より機能面に重点を置いた研究に移行する上で有用な資源となると考えられる。これらの点を考え合わせ、（２）の「おおむね順調に進展している」を選んだ。
|
| 今後の研究の推進方策 |
１）コケ細胞を用いたBiFC：シロイヌナズナのプロトプラストを用いたBiFCで得られた結果を参考にし、コケ細胞を用いて解析を行う。パーティクルガンによる一過的なプラスミド導入により、原糸体細胞を用いて観察を行う予定だが、茎葉体を用いた解析も試みる。また細胞内局在も含め、光条件や植物ホルモン投与の条件を変え、局在や相互作用が環境依存的に調節される可能性を検証する。
２）環境条件依存的なPHK1/2による下流遺伝子の制御機構：野生型株とPHK1/2遺伝子破壊株のあいだのHxk1BとSNF1の発現の違いについて、十分再現性を確認したのちに、培地中の糖濃度、環境の酸素濃度、光条件などの環境条件を変え、野生型株とPHK1/2遺伝子破壊株のあいだで上記の糖代謝関係遺伝子の発現をqPCRで比較し、PHK1/2-TCSが受容しシグナル伝達する環境要因を探る。
３）サイトカイニン・シグナル伝達系とのクロストークの検証：サイトカイニン存在下または非存在下で、サイトカイニンに制御される茎葉体形成制御因子の発現を野生型株とPHK1/2遺伝子破壊株の間で比較する。さらにサイトカイニン・シグナル伝達を担うTCS因子のコケホモログ群と、PHK1/2-TCS因子との相互作用をY2H等により調べる。
４）酸素受容機能の検証：PHK1/2のPASドメインとヘムとの結合を、偽ペルオキシダーゼ活性検出に基づくIn-gelアッセイにより調べ、PHK1/2が酸素センサーとして機能する可能性を検証する。
５）ゲノム比較に基づくPHK1/2-TCSの進化解明：可能な限り多数の多様な緑色植物系統の配列情報を用い、ヒスチジンキナーゼ、HPt、RRについて系統解析を詳細に行い、オルソログ関係を把握するとともに、各系統群に固有の因子を同定し、植物の進化・多様化に伴うTCS因子の構造・機能の推移と多様化を推測する。
|
