| 研究課題/領域番号 |
19K06797
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| 研究機関 | 生理学研究所 |
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研究代表者 |
齋藤 茂 生理学研究所, 生体機能調節研究領域, 助教 (50422069)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 温度適応 / 温度感覚 / 高温忌避 / 温度センサー / 適応進化 / 両生類 / 幼生 |
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| 研究実績の概要 |
環境適応における温度感覚の進化的な変化およびその役割を明らかにするため、無尾両生類を用いた比較解析を進めている。対象の5種（リュウキュウカジカガエル、カジカガエル、ツチガエル、シュレーゲルアオガエル、ニホンアカガエル）は繁殖の時期や利用する水場が異なり、各種の幼生は異なる温度環境に適応してきたと考えられる。例えば、ニホンアカガエルは早春に産卵するために幼生は低温環境で成育するのに対して、リュウキュウカジカガエルは一部の地域では温泉においても幼生が成育できるほどの高温耐性を有している。また、シュレーゲルアオガエルは春から初夏にかけて産卵し、幼生は温暖な時期に成育する。
行動実験により各種の幼生の臨界最高温度および忌避温度を測定した。どちらの値もニホンアカガエルで最も低く、リュウキュウカジカガエルで最も高い値を示し、2つの指数の間には5種間で明瞭な相関関係が認められた。一方で、忌避温度の種差は臨界最高温度のそれより2倍程度大きいことから、異なる温度ニッチに適応する際に忌避温度はより柔軟に変化してきたことが分かった。
次に、高温受容のセンサー分子としてはたらき、多様な動物種において忌避応答に関与するTRPA1のチャネル特性の比較解析を行った。リュウキュウカジカガエルではTRPA1の高温応答性が失われていた。一方、カジカガエルおよびニホンアカガエルではTRPA1は高温により活性化されたが、後者は前者に比べてその活性および感受性が明瞭に高く、TRPA1の温度応答特性と個体レベルの忌避温度の間には密接な関連性があることが示された。これらの結果から、無尾両生類が多様な温度ニッチに適応する進化過程において、高温耐性よりも温度感覚に基づいた忌避応答がより大きな役割を担ってきたこと、また、高温センサーの機能変化が忌避行動の進化的な変化に寄与してきたことが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究では、時空間的に異なる温度環境に適応した無尾両生類の幼生を対象に1）野外調査、2）実験室における行動解析、3）温度センサー分子の機能解析、4）遺伝子改変個体を用いた行動解析の4つの研究手法を主軸に生態から分子レベルまで統合的な研究を展開することを計画した。
そのため、幼生が低温環境で成育する種から高温耐性を持つ種まで複数の無尾両生類種の幼生を対象にした。具体的には、早春に産卵し幼生が涼しい環境で成育するニホンアカガエル、春から初夏の暖かい季節に幼生が成育するシュレーゲルアオガエル、高温耐性を持ち、水温が40℃に達する温泉にも生息するリュウキュウカジカガエル、および、その近縁種で清流に生息するカジカガエル、多様な水場を利用するツチガエルを含む日本在来の5種を対象にした。また、遺伝子改変にはモデル生物であるネッタイツメガエルを用いた。
1)に関連して、リュウキュウカジカガエル、ニホンアカガエル、シュレーゲルアオガエルが成育する水場において継時的な温度測定および野外観察を行い、これらの種の幼生が野外で実際に経験する温度域や高温暴露時の行動観察を行った。また、2)に関連し、5種の幼生の臨界最高温度および忌避温度を測定し、種間で生息地の温度条件に応じた種差があることを明らかにした。更に、3)に関連し、行動実験を行った5種の内、3種から高温センサー分子であるTRPA1とTRPV1を単離し機能解析を進めてきた。4)では、ネッタイツメガエルを用いTRPV1およびTRPA1のノックアウト系統の作出が完了している。
これまでの2年間の研究により1)から3)のアプローチで多くの成果が得られており、4)のアプローチは最も時間を要する遺伝子改変系統の作出が完了しており、最終年度に行動解析を進める準備が整っている。これらのことから本研究課題は順調に進展していると考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
行動解析を行った5種の内、シュレーゲルアオガエルとツチガエルからTRPV1およびTRPA1遺伝子の単離を行い、電気生理学的な機能解析を進める予定である。シュレーゲルアオガエルについてはTRPA1の大部分のcDNA配列は決定できたものの、5’末端近傍の塩基配列が実験的な問題により未解読であるため、機能解析に必要な発現ベクターが未だ作成できていない。しかし、近年、複数の無尾両生類種のゲノム配列が公開されつつあるため、TRPA1の塩基配列を多様な種間で比較することにより保存性が高い領域にPCRプライマーを設計できる状況になってきた。これらのデータを利用してシュレーゲルアオガエルのTRPA1およびTRPV1のクローニングを進めていく。一方で、ツチガエルについてはゲノム配列が本年に公開され、TRPA1の塩基配列情報が入手可能になった。今後、クローニングを進めていく予定である。
次に、幼生の温度応答行動におけるTRPA1およびTRPV1の役割を解明するために、各遺伝子のノックアウト個体を用いた解析も進めていく。世代時間が比較的短いネッタイツメガエルにおいても世代時間は6～8カ月であるため、遺伝子改変個体の作出は律速段階であったが、この2年の間にネッタイツメガエルのTRPV1またはTRPA1の遺伝子破壊系統の作出が完了した。最終年度において野生型および遺伝子破壊個体の幼生を用いた行動解析を行い、高温応答におけるこれらの遺伝子の役割を明らかにしていく予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
試薬やプラスチック製品などの消耗品を一部購入しなかった。コロナ禍の影響で予定していた国際学会が開催中止になり、また、リュウキュウカジカガエルの調査を行っている離島（鹿児島県、口之島）での野外調査を断念せざるを得なかったため、予定していた学会参加費や旅費などを使用できなかった。そのため今年度に予定していた助成金を次年度に繰り越した。今後、実験に必要な試薬や器具などの物品を購入する予定である。
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