チンパンジー/ヒトiPS細胞の初期神経発生動態から探る「ヒト化」の分子基盤

2019 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 19K06864
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 今村 公紀 京都大学, 霊長類研究所, 助教 (80567743)
• 研究期間 (年度): 2019-04-01 – 2022-03-31
• キーワード: iPS細胞 / 神経発生 / ヒト進化 / チンパンジー

研究実績の概要

初年度は、チンパンジーiPS細胞のダイレクトニューロスフェア（dNS）形成における重要なシグナル伝達経路の特定やアストロサイト分化能の確認、dNS形成過程のトランスクリプトームの精査を行った。
具体的には、dNS形成1、3、5、7日目の細胞についてRNA-seqを実施した結果、各細胞は①iPS細胞とdNS（Day 1）と②dNS（Day 3、5、7）に分岐し（1st shift）、次に③dNS（Day 3）と④dNS（Day 5、7）に分岐する（2nd shift）ことが判明した。また、iPS細胞とdNS（Day 1）がグループ1、dNS（Day 5）と（Day 7）がグループ3として比較的近い関係にあり、dNS（Day 3）は両者のグループの中間（グループ2）に位置付けられた。1st shiftと2nd shiftにおける細胞運命を解明するために遺伝子発現を精査したところ、1st shiftでは多能性関連遺伝子の発現消失と神経発生関連遺伝子の発現開始が認められ、多能性から神経発生へのコミットメントが誘発されていることが示された。一方、各dNSのニューロン分化誘導を行ったところ、dNS（Day 3）まではニューロン分化が乏しいものの、dNS（Day 5）以降は高効率でニューロン分化が観察され、2nd shiftではニューロン分化能が獲得されることが判明した。以上より、dNS形成過程においてiPS細胞から後期前方エピブラスト（Day 1）、初期神経上皮細胞（Day 3）、脳胞ラジアルグリア（Day 5、7）へと段階的に発生が進行することが示唆された。
また、2i/LIF培地で初期化・培養したチンパンジー初期化細胞の特性解析を行い、多能性関連遺伝子ではなく神経堤細胞関連遺伝子を発現していること、またdNS形成培養によって末梢ニューロンに分化することを明らかにした。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

申請者が開発したdNS形成培養法により、チンパンジーiPS細胞からの初期神経発生過程についてトランスクリプトーム解析とその精査を行い、論文として発表することができた（Kitajima et al., Stem Cell Research, 2020）。種間比較解析に向けても、ニホンザルiPS細胞のdNS形成培養を行い、チンパンジー同様の初期神経発生を経過することを確認した。また、共同研究を通じて、種特異的な遺伝子発現パターンを示す遺伝子の特定や、エピジェネティックなプロファイリングなども進めている。加えて、2i/LIF培地でリプログラミングしたチンパンジー初期化細胞（2iLコロニー形成細胞）についても並行して解析を行い、研究結果の論文発表を行った（Lin et al., Differentiation, 2020）。　以上より、順当に研究計画を遂行できていると判断する。

今後の研究の推進方策

トランスクリプトーム解析の結果、チンパンジーのdNS形成過程で発現変化量の大きい遺伝子の中には神経発生との関連が報告されていないシグナル伝達関連遺伝子が含まれていた。これらの遺伝子はチンパンジーとヒトのdNS形成で発現パターンが異なり、なかでもJAK/STATおよびEGF経路に関わるある因子は、チンパンジーでは対称分裂期の神経上皮細胞で一過的に発現するのに対し、ヒトでは発現時期が延長されていることを特定している。この因子がヒトの神経幹細胞の対称分裂を亢進し、ヒトの大脳進化とグリオーマリスクに寄与している可能性が推測されることから、今後は強制発現やノックダウン、各種阻害薬を用いたシグナル経路操作による機能解析に着手する予定である。また、dNS形成過程における細胞運命の二回のシフトに重要なシグナル伝達経路の特定を試みる。特に、神経上皮細胞と神経堤細胞の細胞運命のスイッチチングのタイミングとシグナル伝達経路の解析を行う。ヒト特異性を解明する取り組みとしては、ヒトおよびニホンザルのiPS細胞のdNS形成培養を行い、遺伝子発現のトランスクリプトーム解析とその比較を行う。

研究成果

• [雑誌論文] Modeling of early neural development in vitro by direct neurosphere formation culture of chimpanzee induced pluripotent stem cells (2020)
  • 著者名/発表者名: Ryunosuke Kitajima, Risako Nakai, Takuya Imamura, Tomonori Kameda, Daiki Kozuka, Hirohisa Hirai, Haruka Ito, Hiroo Imai, Masanori Imamura
  • 雑誌名: Stem Cell Research 巻: 44 ページ: 101749
  • DOI: 10.1016/j.scr.2020.101749
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Reprogramming of chimpanzee fibroblasts into a multipotent cancerous but not fully pluripotent state by transducing iPSC factors in 2i/LIF culture (2020)
  • 著者名/発表者名: Zachary Yu-Ching Lin, Risako Nakai, Hirohisa Hirai, Daiki Kozuka, Seiya Katayama, Shin-ichiro Nakamura, Sawako Okada, Ryunosuke Kitajima, Hiroo Imai, Hideyuki Okano, Masanori Imamura
  • 雑誌名: Differentiation 巻: 112 ページ: 67-76
  • DOI: 10.1016/j.diff.2020.01.002
  • 査読あり
• [雑誌論文] チンパンジーの細胞をリプログラミング - iPS細胞作製の副産物が示す神経堤細胞様の特性 (2020)
  • 著者名/発表者名: 今村公紀, 仲井理沙子
  • 雑誌名: academist Journal 巻: － ページ: －
  • オープンアクセス
• [学会発表] アカゲザル(Macaca mulatta)における季節性の精巣発達と味覚受容体の関係 (2020)
  • 著者名/発表者名: 杉山宗太郎、糸井川壮大、今村公紀、今井啓雄
  • 学会等名: 第64回プリマーテス研究会
• [学会発表] iPSC初期化因子導入による2i/LIF培養条件下でのチンパンジー線維芽細胞のリプログラミング (2019)
  • 著者名/発表者名: 仲井理沙子、リンザッカリーユーチン、平井啓久、小塚大揮、片山聖也、中村紳一朗、岡田佐和子、北島龍之介、今井啓雄、岡野栄之、今村公紀
  • 学会等名: 第42回日本分子生物学会年会
• [学会発表] 霊長類iPS細胞を用いたヒト進化生物学/進化医学 (2019)
  • 著者名/発表者名: 今村公紀
  • 学会等名: 中部幹細胞クラブシンポジウム2019「『幹細胞人類学』-幹細胞でヒトの発生・生理・疾患・進化を理解する-」
  • 招待講演
• [学会発表] iPS細胞×霊長類学で拡がる研究 (2019)
  • 著者名/発表者名: 今村公紀
  • 学会等名: NBRPニホンザル 第15回公開シンポジウム「ニホンザル研究～ここがおもしろい～」
  • 招待講演
• [備考] iPS細胞を使ってチンパンジーの初期神経発生を誘導 －ヒト脳進化の解明に向けたiPS細胞研究に道－
  • URL: http://www.kyoto-u.ac.jp/ja/research/research_results/2019/200228_2.html