| 研究課題/領域番号 |
19K06915
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| 研究機関 | 立命館大学 |
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研究代表者 |
立花 政夫 立命館大学, 総合科学技術研究機構, 教授 (60132734)
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| 研究分担者 |
小池 千恵子 立命館大学, 薬学部, 教授 (80342723)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 網膜 / 網膜神経節細胞 / 受容野 / 眼球運動 |
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| 研究実績の概要 |
脊椎動物網膜の出力を担う網膜神経節細胞は、それぞれの受容野における光情報を処理するに留まり、広い領域にわたる複雑な情報処理は皮質視覚野で行われると考えられてきた。しかし、眼球運動によって揺動する網膜像の動きを模した広領域にわたる動画像刺激を眼球から剥離した網膜標本に提示すると、網膜神経節細胞群は時空間受容野特性を変化させて協同的な広域情報処理を行うことが見いだされた。本研究の目的は、光刺激に依存して各網膜神経節細胞の受容野特性が動的に変化し、複数の神経節細胞群が協同的に情報処理する仕組みを明らかにし、新たな視覚モデルを提案することである。
回転ドラムに貼り付けた画像を往復運動させ、マウスの視運動性眼振（OKN）を測定した。OKNの計測データから、急速相（急速眼球運動）を抽出し、このパラメーターに基づいた動画像刺激を作成した。剥離網膜標本にマルチ電極法を適用し、動画像刺激に対する網膜神経節細胞のスパイク発火を記録した。新プログラムで各神経節細胞のスパイク発火を抽出し、逆相関法により時空間受容野特性を調べた。
また、マウスの上丘にアデノ随伴ウイルスベクターあるいはコレラ毒素サブユニットB を微量注入し、その部位に投射している網膜神経節細胞を蛍光標識した。このマウスの剥離網膜標本を作製し、蛍光標識された神経節細胞をホールセルクランプして膜特性を調べ、フラッシュ刺激や動画像刺激に対する光応答を記録し、電極からニューロビオチンを注入して樹状突起の形態を共焦点顕微鏡で観察した。これらの結果に基づき、神経節細胞のサブタイプを同定するプログラムを開発した。
網膜内層における神経回路網を解析するために、特定の神経細胞でレポーター遺伝子を発現する遺伝子改変マウスの作製に取り組んだ。網膜オン型双極細胞に発現するTrpm1チャネルを欠損させたマウスの行動異常を調べ、専門誌に発表した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
緊急事態宣言が発令された期間は大学への入構制限措置が取られたため、研究室で電気生理学的や行動実験を計画通りに行うことができなかった。そのため、自宅でも遂行可能な、眼球運動を模した光刺激の作製や、網膜神経節細胞をサブタイプに分類するプログラムの作成に取り組んだ。
また、特定の神経細胞でレポーター遺伝子を発現する遺伝子改変マウスの配偶子を輸入し、その個体化および動物実験施設への搬入を行った。現在、研究対象となるマウスモデルとの掛け合わせを行っており、特徴抽出に関わる網膜内層神経回路網の特定と電気生理学的解析を行う準備段階にある。
剥離網膜標本あるいは網膜スライス標本を用いて、2細胞同時記録できる実験系を組み立てるのに時間がかかったが、現在は、シナプス入力、光応答の同期性や遅延性などについて解析する態勢が整った。
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| 今後の研究の推進方策 |
頭部を固定したマウスにコンピュータモニター上に動画像刺激を提示しても、ほとんど眼球運動を起こさなかった。そこで、回転ドラムに貼り付けた画像を往復運動させたところ、視運動性眼振を生じた。片眼提示に比べて両眼提示では眼球運動の生起確率が高くなるという報告があるので、マウスを取り囲む様に配置した複数のコンピュータモニターに刺激を提示することによって、視運動性眼振以外の眼球運動（滑動性追跡眼球運動、サッケード等）の計測を行う。
これまで、光刺激に対するスパイク発火応答の記録と解析に重点を置いていたが、今後は、ホールセルクランプ法でシナプス入力の解析に焦点をあてる。剥離網膜標本に加え網膜スライス標本を用い、2細胞同時記録を行うことによって、化学シナプス及び電気シナプスを介する情報伝達、応答の同期性などの解析を行う。
蛍光標識された網膜神経節細胞を落射蛍光顕微鏡で観察する際に、マウスの視細胞が強く刺激されない長波長光（＞600 nm）で励起される蛍光トレーサーを脳に注入する。これによって、視物質が褪色して視細胞応答が減弱することを防ぎ、蛍光標識された神経節細胞から動画像刺激に対する応答を記録することが可能となる。また、マーカー遺伝子を導入して蛍光標識された網膜神経節細胞から動画像刺激に対する応答も記録する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
今年度発注した薬品類の国内在庫がなく、輸入に時間がかかり、納入は2021年6月以降の見込みとなったため、次年度の経費で支出することになった。また、レポーター遺伝子を導入したマウスを繁殖させている最中のため、免疫組織化学的染色に必要な抗体等の購入を延期していたが、次年度、実験を遂行する目処が立ったので、次年度使用額と翌年分として請求した助成金を合わせて使用する計画である。
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