| 研究課題/領域番号 |
19K06915
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| 研究機関 | 立命館大学 |
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研究代表者 |
立花 政夫 立命館大学, 総合科学技術研究機構, 教授 (60132734)
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| 研究分担者 |
小池 千恵子 立命館大学, 薬学部, 教授 (80342723)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 網膜 / 網膜神経節細胞 / 受容野 / 眼球運動 |
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| 研究実績の概要 |
マウスの剥離網膜標本にマルチ電極法を適用し、眼球運動を模した動画像刺激に対する網膜神経節細胞のスパイク発火を記録した。各神経節細胞のスパイク発火を抽出して逆相関法により時空間受容野特性を調べた。また、マウスの上丘表層にアデノ随伴ウイルスベクターあるいはコレラ毒素サブユニットBを微量（nLオーダー）注入し、その部位に投射している少数の網膜神経節細胞を蛍光標識した。このマウスの剥離網膜標本を作製し、蛍光標識された神経節細胞の形態を共焦点顕微鏡で観察してサブタイプに分類し、どのサブタイプ同士が近傍に分布するかを解析した。
網膜内層における神経回路網を解析するために、遺伝子改変マウスの網膜について、光応答特性を調べた。網膜ON型双極細胞に発現するTrpm1チャネルを欠損させたマウス（Trpm1 KOマウス）の網膜では神経節細胞がオシレーションを発生する。神経節細胞にホールセルクランプ法を適用した結果、オシレーションは神経節細胞自体ではなく、シナプス入力によって発生していることがわかった。そこで、杆体（ON型）双極細胞と神経節細胞間に介在するAIIアマクリン細胞の電気生理学的特性を調べた結果、Trpm1 KOマウスでは、AIIアマクリン細胞の静止膜電位が過分極方向に移動していることがわかった。また、接着因子裏打ちタンパク質を欠損させた網膜では、視細胞層がロゼッタ構造を形成する。網膜電図を測定すると、a-waveとb-waveの振幅や潜時に異常が見られるのみならず、マルチ電極法で神経節細胞の光応答を解析すると、ON型細胞よりもOFF型細胞の方が有意に減少していることがわかった。網膜内網状層を形態学的に調べたところ、OFF層が薄くなっていることを見いだした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
緊急事態宣言/蔓延防止等重点措置が発令された期間は大学への入構制限措置や研究室での人数制限が取られたため、研究室で電気生理学的実験や行動実験を計画通りに行うことができなかった。そのため、新たなデータを取得するペースが落ち、既に得られたデータの解析に集中せざるを得なかった。剥離網膜標本にマルチ電極法を適用して記録したデータの解析では、スパイク発火のタイミングが光刺激条件と対応しないことが判明し、その原因がコンピュータモニターの特性であることがわかるまでに時間を要した。
また、薬品類を注文しても、国内在庫がなくて海外発注になった場合は、製造・輸送に時間がかかり、入手までに1ヶ月以上かかるケースがあり、その間、実験が中断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
光刺激提示用のコンピュータモニターを交換した結果、プログラムどおりの光刺激を提示することができることが確認できた。そこで、剥離網膜標本にマルチ電極法を適用して、さらに電気生理学的データを取得し解析する。
また、遺伝子改変マウスにおける網膜神経節細胞のオシレーションに関しては、網膜スライス標本に穿孔パッチクランプ法やダブルパッチクランプ法を適用して、野生型マウス網膜に比べて、神経細胞の静止膜電位やシナプス伝達機構等がどのように変化しているかを調べ、オシレーションの発生機構を明らかにする。接着因子裏打ちタンパク質欠損マウスの網膜で見つかった外網状層及び内網状層の異常がどのような原因によるものなのかを、免疫組織化学的、形態学的に調べる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
新型コロナの影響で、実験の遂行が遅れたため、最終年度を1年延長し2022年度までとした。そのため、物品費の支出を2022年度に執行することにした。
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