| 研究課題/領域番号 |
19K06939
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| 研究機関 | 福井大学 |
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研究代表者 |
辻 隆宏 福井大学, 学術研究院医学系部門(附属病院部), 助教 (40787389)
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| 研究分担者 |
辻 知陽 金沢大学, 子どものこころの発達研究センター, 特任准教授 (00523490)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | バソプレシン / 時差ぼけ / 発達障害 / 光同期 / DREADD / iDTR / AAV2 |
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| 研究実績の概要 |
時差ぼけはシフトワーカーにとって、健康を維持するためには問題となる状態である。睡眠障害だけでなく、メタボリックシンドロームの原因となる。一方、神経ペプチドであるバソプレシン(AVP)は、体内水動態だけでなく、中枢にも機能するペプチドである。AVPは時差ぼけ、特に概日リズムの光同期に関わっていることが報告されているが、その分子機構についての詳細は不明である。申請者が見つけた、AVP陽性網膜神経節細胞の中枢時計である視交叉上核への投射経路の生理的役割を調べるため、AVP陽性網膜神経節細胞を操作するモデルマウスを作成に着手した。前回の報告で、AVP依存的にCre recombinaseを発現するマウスの網膜神経節細胞にCre recombinaseが発現していることを報告した。ウイルスによる網膜特異的なAVP細胞の人為的操作をするマウスを作成するため、網膜でAVP特異的に発現するウイルスを検索した。はじめに、容易に入手できるAddgeneのウイルスを試したが、脳内では発現したが、網膜では発現量が低いかほとんど発現しなかった。ついで、協力研究者よりウイルスのサブタイプを含めて、いくつかウイルスを入手した。その結果、AAV2-CAGGS-Flex-EGFPが最もよく網膜に発現することがわかった。現在、Cre依存的に人工的な受容体 (hM3DqやhM4Di)を発現させ神経を活性・抑制させる 方法 (DREADD法）や diphtheria toxinの受容体（iDTR)を発現させ、diphteria toxinによる細胞死を起こす方法を導入するため、このAAV2-CAGGS-Flex-EGFPをもとに導入ベクターを作成中である。一方、概日リズムの時差ボケモデルの基礎実験を行っており、光の強さによる時差ボケの変化量やマウスの種差、発達障害モデルマウスを使って検証中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
今年度には、モデルマウスを作成するためのウイルスベクターが完成している予定であった。残念ながら、脳内で発現することが分かっていた、Addgeneより購入したウイルスベクターが網膜では発現せず、協力研究者より入手したAAV2-CAGGS-Flex-EGFPが網膜に発現することがわかった。現在、モデルマウス作成のためのベクターを作成しているところである。
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| 今後の研究の推進方策 |
現在、AAV2-CAGGS-Flex-EGFP-hM3Dq、AAV2-CAGGS-Flex-EGFP-hM4DiやAAV2-CAGGS-Flex-EGFP-iDTRベクターを作成している。人工受容体のDREADDは点眼により神経の活性の操作ができることが示唆されている（Keenan et al., Frontiers in neural circuit, 2017)。Cre recombinase依存的にhM3DqやhM4Diを発現するマウスがJackson laboratioryから入手が可能である。網膜AVPの発現を確認したAi9 (Cre recombinase依存的にtdtomatoを発現）マウスのtdtomatoの部位の改変で作成されているため、網膜AVP細胞でこれら受容体が発現できる可能性が高い。したがって、ウイルスが機能しなかった場合、これら変異マウスをJackson Labolatoryより購入する。発現確認後、人工受容体のリガンドであるCNOの点眼により時差ボケ行動が改善あるいは悪化するかを確かめる実験を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
残金６６９円であり、次年度の消耗品に使用する予定である。
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