| 研究課題/領域番号 |
19K06940
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
笠井 昌俊 京都大学, 医学研究科, 助教 (70625269)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 上丘 / 視覚野 / 経シナプス AAV / ２光子顕微鏡 / カルシウムイメージング / in vivo / 光遺伝学 / 化学遺伝学 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では，中脳の初期視覚中枢である上丘の視覚機能を明らかにすることを目的とする．特に，大脳皮質視覚野と上丘の間で作られる神経回路ループに着目して，２つの脳領域でやり取りされる視覚情報の可視化，及び，神経経路を選択的に操作することにより，視覚応答または動物の行動にどのような影響が出るかを確か，上丘－視覚野の神経回路の生理学的な意味を明らかにすることを試みる．
令和１年度としては，大脳皮質初期視覚野（V1）から上丘へ投射する神経細胞を選択的に可視化するため，アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターを用いた，経シナプス感染の手法を行った．すでに報告のあるこの手法を用いて，AAV1-hSyn-Cre をマウスの右側の V1 に注入し，さらに，右側の上丘に AAV1-hSyn-Flex-GCaMP6m を注入した．V1 から経シナプス的に AAV の感染が 上丘に広がり，上丘で発現した V1 由来の Cre recombinase と上丘に注入した Cre 依存的に GCaMP を発現させる AAV が機能し，実際に上丘の神経細胞に，GCaMP が発現させることができた．
同様に，逆行性に感染する AAV （AAV-retro）を用いて上丘に直接神経投射を持つ V1 の神経細胞に，光感受性イオンチャネルである stGtACR2 を発現することができた．特に V1 の特定の場所が上丘のどこに投射するかを確かめることができたので，その情報を元に，より効率的に V1－上丘間のネットワークを調べることが可能になると期待している．
さらに，上記の上丘に GCaMP を発現させたマウスについては，これまでに申請者が行なってきた，２光子顕微鏡による上丘からの in vivo カルシウムイメージング法をもちいて，特定の神経経路由来の上丘の神経活動を確かめることに成功している．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
令和１年度は，経シナプス AAV 法がどの程度可能か確かめた．AAV1-hSyn-Cre を右側の V1，３ヶ所に微量注入した．注入時の漏れなどを考慮して，１週間後に，Cre 依存的にカルシウム感受性傾向タンパク質である GCaMP を発現させる AAV1-hSyn-Flex-GCaMP6m を同側の上丘3－5ヶ所に広く注入を行った．約４週間後に，上丘上にガラス窓を設置する手法により，生きたマウスの上丘から２光子顕微鏡で観察したところ，上丘浅層の多くの神経細胞に GCaMP による緑色の蛍光が観察できた．実際に，マウスに視覚刺激を提示したところ，GCaMP を発現した上丘の神経細胞から視覚応答を取得することができた．現在は，得られたデータを解析し，V1 から投射を受ける上丘の神経細胞の視覚応答特性を調べているところである．
V1 -> 上丘の神経回路を，人工的に操作するために，光感受性イオンチャネルである JAWS もしくは stGtACR2 を逆行性 AAV ベクターを用いて V1 に発現させる手法を検討した．まず AAV-retro-hSyn-JAWS-GFP を上丘に注入し，GFP の蛍光を V1 に確認した．発現効率の確認のため，AAV-retro-pmSyn1-BFP-Cre を上丘に打ち，さらに V1 に AAV1-hSyn1-SIO-stGtACR2-FusionRed を注入した．どちらの手法でも，V1 に置いて GFP もしくは FusionRed の蛍光を肯定したマウスの脳標本から確認している．実際にこのオプシンに対して，光遺伝学的に神経活動をコントロールできるか調べるために，V1上に光ファイバーカニューレを挿入した．しかし，イメージングしている上丘と V1 の位置が非常に近接しているため，カニューレの角度や位置を検討している．
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| 今後の研究の推進方策 |
V1 由来の情報は上丘の視覚応答にどのように影響するかを確かめるため，経シナプスAAVによってられたデータの解析を進めるとともに，マウスの頭数を増やしていく予定である．データ解析には，HHMIの研究所で開発されている Suite2P による解析環境を整えた．すでに自作の MATAB の解析ツールと組み合わせるために，Suite2P による画像処理と細胞（ROI）の検出と，自作ツールによる視覚応答の解析の効率化を進目ていく予定である．
光遺伝学との組み合わせでは，カニューレの位置の最適化を進める．とともに，チップ LED を頭蓋骨表面にはるような手法を検討中である．また，当初の計画通り，化学遺伝学的に V1 の活動を抑制する手法についても検討，実行を進めていく予定である．科学遺伝学法については，プローブの腹腔投与を検討していたが，マイクロダイアリシス用のカニューラを用いたより限局した場所への微量注入の可能性についても検討していく．
一方で，現在の新型コロナによる日本国内を含めた世界的な活動制限により，必要なウイルスベクターや，機器が手に入らないものが既にある．この点を考慮しつつ，最低限でも進められる計画を再検討中である．
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| 次年度使用額が生じた理由 |
新型コロナ感染拡大による学会の現地開催中止による旅費の使用中止及び，機器及び，実験動物の発注の中止によるもの．
現在使用している2光子レーザ顕微鏡の不具合が発生しており，その修理調整費用として使用する可能性あり．
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