| 研究課題/領域番号 |
19K06970
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| 研究機関 | 東京工業大学 |
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研究代表者 |
門之園 哲哉 東京工業大学, 生命理工学院, 助教 (10510282)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 中分子創薬 / 創薬デザイン技術 / タンパク質分子設計 / 抗体代替分子 / 標的結合小型タンパク質 |
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| 研究実績の概要 |
(1)2019年度に構築したプラスミドを大腸菌に導入し、Multi-FLAPタンパク質、軽鎖CDR由来ペプチドのみあるいは重鎖CDR由来ペプチドのみを足場に組み込んだ小型タンパク質を発現させて精製した。
これらのタンパク質は全て可溶体として発現し、FPLCを利用したアフィニティクロマトグラフィで容易に精製できた。
(2)精製タンパク質のHER2への結合力をELISAにより測定したところ、Multi-FLAPの解離定数KDは58 nMと強く抗原に結合することが分かった。また、軽鎖CDR由来ペプチドのみあるいは重鎖CDR由来ペプチドのみを足場に組み込んだ小型タンパク質のKDはそれぞれ3700 nMあるいは620 nMであった。つまり、重鎖CDR由来ペプチドのみ、あるいは軽鎖CDR由来ペプチドのみでは結合力は非常に弱いが、重鎖CDR由来ペプチドと軽鎖CDR由来ペプチドを同時に組み込むことにより、結合力が飛躍的に高まることが明らかになった。
(3)さらに詳細に結合様式を検証するために、HER2とMulti-FLAPの複合体モデルを作成し、ドッキングシミュレーションを利用して組み込んだ残基の結合エネルギーを予測した。その結果、重鎖CDR由来ペプチドの方は大きな結合エネルギーを持っていたが、軽鎖CDR由来ペプチドのエネルギー的な寄与は少ないことが示唆された。ELISAでの結果と合わせると、申請者の仮説「結合エネルギー的には寄与が少なくても、複数のCDRにまたがって結合点を持つことで抗原認識領域が広がり、複合体形成に有利に働く」を支持する結果である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
本研究では抗体医薬の中分子化のためのデザイン理論の確立を目指している。そのために、①足場分子のイン・シリコ・スクリーニング(2019年度)、②Multi-FLAPのデザインと結合力予測(2020年度)、③Multi-FLAPの結合力評価と仮説の検証(2020-2021年度)、④Multi-FLAPの有用性評価(2021年度)の4つのマイルストーンを計画している。2020年度の研究によって既に③の「Multi-FLAPの結合力評価と仮説の検証」まで終了しており、当初計画以上に進展している。
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| 今後の研究の推進方策 |
(1) 本研究期間後に、Multi-FLAPを診断薬、治療薬として高機能化を目指していくための準備を行う。Multi-FLAPは分子サイズが10 kDaと小さいため、生体内に投与すると速やかに腎排泄されて効果が持続しないという課題が考えられる。そこで、血中滞留性を高めて腫瘍への集積効率を高める方法を検討し、有用性を評価する。
(2) 2019年度、2020年度と当初の計画以上に研究は進捗している。そこで、Multi-FLAPを超える高機能FLAPをデザインする新たな方法論を考案し、予備検討を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
購入予定であった薬用冷蔵ショーケースの設備備品費、研究成果発表のための旅費が必要なくなったため、その分が次年度繰越額として生じた。当初の計画以上に研究が進展しているため、次年度ではMulti-FLAPの有用性評価に加えて新たなFLAPデザインの予備検討を実施する予定であり、それらの研究に必要な消耗品費として利用する。
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