| 研究課題/領域番号 |
19K07020
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| 研究機関 | 神戸薬科大学 |
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研究代表者 |
田中 将史 神戸薬科大学, 薬学部, 准教授 (40411904)
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| 研究分担者 |
山田 俊幸 自治医科大学, 医学部, 教授 (50211636)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 血清アミロイドA4 / アポリポタンパク質 / HDL / Hisタグ |
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| 研究実績の概要 |
アポリポタンパク質として脂質代謝を担う血清アミロイドA（SAA）にはいくつかの種類が存在する。これまでは、関節リウマチなどの炎症性疾患に伴って血中濃度が著増する急性期型のSAA（主にSAA1）に関する研究を行ってきた。それに比べ、SAA4は正常時の血中に高濃度で存在するにもかかわらず、生体内での機能や疾患との関連性が不明であるがゆえにこれまで注目されることがなかった。しかしながら近年、病態や加齢によってSAA4の発現量や糖鎖付加割合が変化することが報告され、この現象がなぜ起こるのか疑問を抱いた。そこで本研究では、未解明な部分の多いSAA4に焦点をあて、①まずはSAA4の基本的性質（構造・物性）を理解すること、②脂質代謝機能（生理的意義）に関する手がかりをつかむこと、③糖鎖付加の意義（特に病理的な意義）の解明につなげることを目的とした。今年度は、昨年度に引き続き、肝臓由来の細胞株（HepG2）から分泌されるSAA4について調べた。その結果、IL-6およびIL-1βを添加した場合にSAA4の分泌量が増加すること、および、SAA4がHDLとともに分泌されることが示唆された。また、調製したHisタグを有するSAA4からHisタグを除去する方法を検討した。切断条件の最適化には至っていないが、ある程度の良い感触は得ており、精製後、Hisタグの有無による構造への影響について明らかにしていく。二年目は新型コロナウイルス感染症に関連する対応で計画通りに進行しなかったが、着実に前進しており、今後、当初の目的であるSAA4の基本的性質の理解と生理的・病理的意義の解明に少しでも繋げたい。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
肝臓由来の細胞株（HepG2）からのSAA4発現について調べた。細胞培養液中のグルコース濃度の変動ではSAA4の分泌量に大きな変化がなかったのに対して、IL-6およびIL-1βを添加した場合にはSAA4の分泌量が増加した。そこで、超遠心を用いた浮上分画法により培養液を分離したところ、HDL画分でSAA4が検出されたが、LDL画分では検出されなかった。すなわち、SAA4がHDLとともに分泌されることが示唆された。しかしながら、培養液中にもともと含まれる成分が影響している可能性も否定できない。また、実験によってはglycosylated SAA4のバンドが検出されないこともあり、この理由についても検討が必要であると考えている。また、N末端領域にHisタグを有するnon-glycosylated SAA4を用い、Hisタグの除去条件を改めて検討した。切断酵素であるエンテロキナーゼの量、反応温度、反応時間等を変化させ、電気泳動により分離後、タンパク質全体およびHisタグをそれぞれ染色した。その結果、目的外の部位で切断が起こる場合や切断効率が著しく低くなる場合等があり、現在までのところ最適条件の決定には至っていない。
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| 今後の研究の推進方策 |
SAA4の分泌量の変化に関しては、上述のように、何かを示唆するといったデータは出ているものの、確証のあるデータとはなっていないため、条件を精査した上で検討を継続していく。幸い、設備と人材の整備ができ、研究の加速が可能な環境となっている。Hisタグの除去に関しては、引き続き最適条件の検討を行うが、ある程度の収率が得られた段階で検討を打ち切り、会合性や脂質結合性などに及ぼすHisタグの影響を調べる。さらには、これまで具体的な検討のできていないglycosylated SAA4の準備に取り掛かる。
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