| 研究課題/領域番号 |
19K07033
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| 研究機関 | 神戸薬科大学 |
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研究代表者 |
大山 浩之 神戸薬科大学, 薬学部, 講師 (80572966)
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| 研究分担者 |
森田 いずみ 神戸薬科大学, 薬学部, 講師 (20299085)
小林 典裕 神戸薬科大学, 薬学部, 教授 (90205477)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 抗体工学 / 抗メタタイプ抗体 / ファージ提示 |
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| 研究実績の概要 |
免疫測定法は、簡便かつ迅速に多検体の分析試料を処理することが可能であり、臨床検査や診断薬に多用される。サンドイッチ型のELISAは異なる2種の抗体を用いることで高い感度や特異性が得られる。しかし、ステロイドなどの低分子化合物はその分子サイズゆえにサンドイッチ型ELISAへの適用は原理的に困難であった。このため競合型ELISAでの測定に頼らざるをえないが、抗原抗体複合体を認識する抗メタタイプ抗体が得られるならばサンドイッチ型ELISAの構築が可能となる。しかし、動物を免疫する従来法では複合体が血中で解離することにより、目的の抗体は得がたいことが予想された。そこで、本申請研究ではアルドステロン（Ald）をモデル抗原として、単一ドメイン抗体ライブラリーをファージ提示させたのち、抗メタタイプ活性を有するファージの選択を試みた。まず、抗Ald抗体をペプシン処理して得られたF(ab’)2フラグメントを96ウェルプレートに固定化したのち、Aldを加えてインキュベートしたのち培地を添加した。ここへライブラリーを寒天培地に塗布して得られた大腸菌のコロニーおよびヘルパーファージを加えて培養し、抗体提示ファージを調製しつつ、自作のNanoLucルシフェラーゼ融合抗ファージscFvにより抗メタタイプ活性を有するファージを発光強度からモニタリングした。ライブラリーのうち計1880種のコロニーについて調べたところ、10万カウント以上の発光強度を示すウェルは26種であった。これらの抗体提示ファージのうち良好な反応性を示すクローンについてELISAによりAld-抗Ald抗体複合体に対する反応性を詳細に検討した。その結果、抗Ald F(ab’)2を固定化したウェルにおいて、Ald (100 ng/assay) 存在下で非存在下に比べ約2倍高いシグナルを示すファージクローンが8種得られた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
2020年度の計画では、変異scFv抗体ライブラリーを用いて得られた変異抗体クローン7種について、これらを用いるELISAの感度向上を目的とした2次変異抗体ライブラリーの構築と新たな変異抗体の選択を予定していた。しかし、新型コロナウイルス感染症の影響により、大規模スクリーニングに必要な人手と時間が失われた結果、研究計画の再考を余儀なくされた。そこで、抗原抗体複合体のような複雑な構造変化を認識するのに有利な構造を有する単一ドメイン抗体のライブラリーを新規に調製し、scFvライブラリーから得られた変異体のAld存在下/非存在下での反応性を上回るファージクローンの探索を試みている。今のところ、スクリーニング数が不十分であるが、わずか2000クローンに満たない検索で高いシグナルを示す変異体が得られていることから、スクリーニングを重ねることでより有望なファージクローンの選択が可能ではないかと期待している。
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| 今後の研究の推進方策 |
研究開始当初はIgG抗体を低分子化したF(ab’)2を固定化抗体として用いていたが、目的の複合体を認識しない非特異的なファージが多く選択されており、期待する抗メタタイプ活性を有する変異体の取得には至っていない。このようなファージの検出を低減させる目的として固定化抗体の低分子化を検討している。具体的には、F(ab’)2よりもさらに低分子化した人工の抗体分子である一本鎖Fvフラグメント(scFv)の活用を考えているが、scFvはプレート表面への直接固定化により抗原結合能が低下することが明らかになった。今後の推進方策としてscFvのC末端にできる限り小さなペプチドタグを導入した融合タンパク質を調製し、抗原結合能を維持した状態でプレートへの間接的な固定化を試みる予定である。この融合タンパク質の調製には既に着手しており、大量生産に向けて準備中である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
コロナ禍で予定していた計画通りに研究を進めることが難しかったが、研究環境が改善しつつあり、当初の計画を遂行するために補助金を有効活用し、次年度使用額とすることとした。次年度に必要な試薬を購入することで、有効に活用する計画である。
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