| 研究課題/領域番号 |
19K07043
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| 研究機関 | 岐阜大学 |
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研究代表者 |
上田 浩 岐阜大学, 工学部, 教授 (50253779)
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| 研究分担者 |
赤尾 幸博 岐阜大学, 大学院連合創薬医療情報研究科, 特任教授 (00222505)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | GPCR / エクソソーム / 細胞外小胞 / small GTPase |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、エクソソーム産生機構には、エンドサイトーシスにより形成される多胞性エンドソーム(MVE)の関与が重要であり、それらの形成には三量体G蛋白質共役型受容体(GPCR)を含む各種レセプターからのシグナルが深く関与していることに着目し、エクソソーム産生に影響を与えることが予想されるGPCRシグナルを手掛かりにして得たいくつかの候補分子の中から、エクソソーム産生制御の中心的役割を担う分子を同定することを目的としている。そこで、本年度は、まず各種三量体G
蛋白質αサブユニット及びβγサブユニットにより、細胞外小胞が放出されるのかどうについて、HEK293細胞に、各種GPCR刺激を行い、その細胞培養液を超遠心し、その沈殿物について、Nanosightにより解析、及びエクソソームマーカーであるCD63やCD81及びアリックス等の特異抗体を用いイムノブロットを行い、それらにより細胞外小胞の量的な違いがあるかを解析した。また、Nanoluc融合CD81や、CD63などを共発現させた細胞で、各種条件における細胞培養液中へのNanoluc活性の放出量等も測定した。その結果、ある種の刺激時のみ、優位に細胞外小胞の放出量が増加していることが明らかとなった。また、この条件で、細胞外小胞の有意な上昇が見られた細胞培養液から得たサンブル中には、マーカーとなるCD63などの存在が明らかに増加していることもイムノブロットの結果から明らかとなった。これらのことから、ある種のGPCR刺激により、細胞外小胞が放出されることが明らかとなり、そのシグナルに関与する細胞内分子の同定を行うことで、この放出機能の詳細を明らかにすることができると考えられる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初予定していた計画では、今年度中に、シグナル経路等を同定することになっており、それについて、大きなシグナル経路を見出せたと考えらえる。また、それらに関わる細胞内分子についても、概略では、記載していないが、いくつかの分子について検討をつけ、今後それらについて詳細を検討することを予定している。以上のことから概ね順調に進展しているという判断をした。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は、当初の計画の通り、まず、現在同定しているエクソソームを含む細胞外小胞放出に関われるシグナル経路で、働くと考えらえる候補細胞内分子のいくつかについて、それらが細胞外小胞の放出を増強するかどうかなどについて検討する。そのために、まず、関連分子の発現ベクター等を構築することなどを行う。その後、それらを使って、細胞外小胞放出との関係性などについて、NanosightやNanoluc技術を用いて解析するとともに、それらの実験の進展に従って、関連分子の各種遺伝子変異体などを調製し、さらにそれらを使用して、その詳細を調べていく。また、放出された細胞外小胞に詰め込まれている物質についての情報を得るため、MS解析により含有タンパク質の種類なども解析する。また、このシグナルにより、他の細胞でも同様に、細胞外小胞を放出する細胞等があるかどうかも検討していく。
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