| 研究課題/領域番号 |
19K07044
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| 研究機関 | 岡山大学 |
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研究代表者 |
児玉 進 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 准教授 (20621460)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 核内受容体 / 異物センサー / ヘテロ2量体 / 転写調節 |
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| 研究実績の概要 |
本研究は、核内受容体PXRとCARの二面的機能、【１】転写活性化と【２】転写抑制において、ヘテロ２量体パートナーRXRがどのように協働するのか、その分子機序の詳細を明らかにすることを目指す。
項目【1】初年度の結果を基に、マウス型CARの解析を優先して進めた。これまでの解析結果より、CAR/RXRヘテロ2量体は、結合DNA配列の違いによって、RXRアゴニストに対する応答性が異なり、配列Aでは転写活性が増強され、一方、配列Bでは影響を受けないことを見出している。そこで、より詳細な解析を実施するため、①より高いリガンド応答性を有する変異型CARの導入、②他の遺伝子由来の配列Aと同タイプの配列、の検討を進めた。また、RXR自身はホモ2量体としても機能するが、RXRホモ2量体は配列AとBに作用しないことを確認した。また、コアクチベーターとの相互作用におけるRXRアゴニストの影響について、配列AとBを用いた予備検討を実施し、各々のレポーターコンストラクトに対して作用するコアクチベーターを複数選定すると共に、各コアクチベーターの活性化への寄与が結合配列によって異なることが示された。項目【1】に関連して、ヒトCAR活性化物質の新たなインビトロ評価系の構築に取り組んだ。その結果、既知アゴニストとアンタゴニストに対する反応性を指標に構成因子を選定し、評価系構築における基本情報を得た。項目【2】前年度に引き続き、解析モデルに選定した標的遺伝子Aプロモーターのレポーター解析をPXR及びRXRの各機能ドメインの欠失型を用いて実施した。その結果、各々受容体において転写抑制に必要なドメインが異なることを示唆する結果を得た。また、PXR標的遺伝子を新たに同定し、同様の解析を進めた。さらに、内在性標的遺伝子の解析基盤として、エピソーム型発現ベクター形質転換を用いた安定発現細胞株の作成手法を確立した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本研究は、PXRとCARが有する二面的な転写調節機能におけるRXRとの協働の分子機序の解析を目的とする。
項目【1】について、本年度はマウス型CARについて優先的に解析を進めた。これまでに、CAR/RXRヘテロ2量体が結合するDNA配列によって、その転写活性へのRXRアゴニストによる影響が異なることを示す結果を得た。次いで、結合DNA配列によって、CAR/RXRによる転写活性化に対するコアクチベーターの寄与率が異なることを示す基礎的結果を得た。 そこで次年度は、CARの転写活性化機能におけるRXRとの協働の分子機序について、結合DNA配列とコアクチベーター、これらに着目して解析を進める。また、先行するマウス型CARの解析結果をヒト型CAR及びPXRについての解析実施に反映させる。一方、ヘテロ２量体の転写共役因子との相互作用解析に向けたセルフリー試験系の構築に遅れが生じた。また、ヒト型CAR活性化物質のインビトロ評価系構築に取り組み、その確立に向けた基本情報を得ることができた。項目【２】について、本年度は解析モデルのレポーター解析に各種の機能欠失型核内受容体コンストラクトを取り入れ、PXRとRXRそれぞれの転写抑制に必要とする機能ドメインが異なることを示唆する結果を得ている。また、今年度、安定発現細胞株の作成手法を確立し、内在の標的遺伝子の解析を行う基盤が整えられた。
よって、今後、取り組むべき課題などへの対応は明確化されており、項目【1】と【2】について、CARとPXR、それぞれの特徴に基づき、最終的な目的に向けて解析を進めることが可能であると考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
基本的には、交付申請書に記した計画に従い研究を進める。
項目【１】について、今年度に引き続き、マウス型CARについて解析を優先的に進める。特に、これまでに見出した配列Aと配列Bにおける差異に着目する。マウス型CARの解析で得た知見をヒト型CAR及びPXRについての解析実施に反映させる。並行して、ヒトCAR活性化物質のインビトロ評価系の構築、それを用いた新規ヒト型CARアゴニストの同定を試みる。また、引き続き、ヘテロ２量体の転写共役因子との相互作用を解析するためのセルフリー試験系の構築、に取り組む。項目【2】について、機能欠失型核内受容体コンストラクト及び転写共役因子の導入発現などを組み合わせ、解析モデルのレポーター解析を進める。また、安定発現細胞株、siRNA遺伝子ノックダウンなどの手法を用いて、内在の標的遺伝子を対象とする解析を実施する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
【理由】
本年度は、項目【１】について、CARについて優先的にレポーター解析を軸に解析を進め、また、化学物質のCAR反応性のインビトロ評価系構築に取り組んだ。その為、他方、ヘテロ２量体の転写共役因子との相互作用解析に向けたセルフリー試験系の構築に遅れが生じた。これらの理由から、予定額と実支出額に差異が生じた。
【使用計画】
次年度、本研究課題の目的達成に向けて、研究計画及び推進方策に沿いながら、研究費を研究遂行に使用する。その内訳として、今年度に引き続き、受容体アゴニストの評価系構築と同定、さらに、受容体タンパク質の発現・精製、タンパク質間相互作用解析に必要な試薬類や消耗品の購入を中心に、また、得られた本研究の成果を学会及び学術雑誌において発表する為に使用する。
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