2021 年度実施状況報告書

より現実的な化学物質のリスク評価を目指した生体異物センサー機能調節機序の解明

研究課題

研究課題/領域番号	19K07044
研究機関	岡山大学
研究代表者	児玉進岡山大学, 医歯薬学域, 准教授 (20621460)
研究期間 (年度)	2019-04-01 – 2023-03-31
キーワード	核内受容体 / 異物センサー / ヘテロ２量体 / 転写調節
研究実績の概要	本研究は、核内受容体PXRとCARの二面的機能、【1】転写活性化と【2】転写抑制において、ヘテロ２量体パートナーRXRがどのように協働するのか、その分子機序の詳細を明らかにすることを目指す。項目【1】これまでの結果を基に、マウス型CARの解析を優先して進めた。CAR/RXRヘテロ２量体の標的DNA応答配列を組み込んだレポーターコンストラクト、それぞれの野生型とAF2ドメイン変異型を組み合わせインビトロ・レポーター解析から、CARとRXR、各々のAF2ドメインの転写活性化への寄与（リガンド応答、基本転写活性）が異なることを見出した。次いで、ツーハイブリッド法などを用い、各種コアクチベーターのCAR/RXR２量体の転写活性能への寄与を検討した結果、コアクチベーターに因ってRXRアゴニストに対する応答性が異なることが示された。また、CARの解析結果を踏まえ、ヒト型PXRについても同様の解析を進め、PXRとRXRのアゴニスト単独処理及び共処理下、変異型受容体の導入、またコアクチベーター共発現下での応答性に関する基礎的結果を得た。項目【1】に関連して、前年度に引き続き、転写共役因子との相互作用に基づいた化学物質-核内受容体間相互作用のインビトロ評価系（培養細胞）の構築を進め、ヒト型CARに加え、ラット及びヒト型PXRの評価系の基盤を構築した。さらに、これまでに見出していた化学物質の情報を基に、インビトロ及びインシリコ解析を実施して、既知物質とは構造的に大きく異なる新たなRXRアゴニストの基本構造とその置換基における構造活性相関を明らかにした。項目【2】ヒト肝癌由来HepG2細胞にエピソーム型発現ベクターを形質転換したヒトPXR安定発現細胞株を作成し、PXR活性化物質処理に応答した標的となる内在遺伝子のmRNA発現レベルでの変動（誘導、抑制）を確認した。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 3: やや遅れている理由本研究は、PXRとCARが有する二面的な転写調節機能におけるRXRとの協働の分子機序の解析を目的とする。項目【1】について、引き続き本年度も、マウス型CARの解析を優先して進め、CARとRXR、各々の野生型とAF2ドメイン変異型を用いた解析から、ヘテロ２量体のリガンド応答、基本転写活性などにおける２つの受容体間の優先性などに関する情報を得ると共に、ヘテロ２量体に作用するコアクチベーター間でRXRアゴニストに対する応答性が異なることを示す基礎的結果を得た。また、ヒト型PXRについて同様の解析を進め、PXR及びRXRアゴニストに対する応答性やコアクチベーターに関する基礎的結果を得た。並行して、転写共役因子との相互作用に基づいた化学物質のCAR及びPXRとの相互作用評価系の構築が進展し、その過程で両核内受容体のコアクチベーター/コリプレッサーとの相互作用における基礎的情報を得ることができた。そこで次年度は、CAR及びPXRのRXRとのヘテロ２量体機能における協働の分子機序について、各々のアゴニストに応答したコアクチベーター、加えてコリプレッサーとの相互作用に着目して解析を進める。培養細胞系での解析が進展する一方、ヘテロ２量体の転写共役因子との相互作用解析に向けたセルフリー試験系の基盤構築の進捗が停滞している。項目【2】について、エピソーム型ヒトPXR発現ベクターを導入した安定発現細胞株を作成し、内在性の標的遺伝子の発現解析が進展した。よって、今後取り組むべき課題、またその対応は明確であり、項目【1】と【2】について、最終的な目的に向けて解析を進めることが可能であると考える。
今後の研究の推進方策	基本的には、交付申請書に記した計画に従い研究を進める。項目【1】について、引き続き、CAR及びPXRのRXRとのヘテロ２量体機能における協働の分子機序について、各々アゴニストに応答したヘテロ２量体と転写共役因子との相互作用の解析を進める。この場合、特に、転写共役因子の機能的な違いに着目する。また、核内受容体について、複数種のアゴニストを用いる他、インバースアゴニストやアンタゴニストについても検討する。また引き続き、セルフリー試験系の構築を進める。加えて、化学物質-核内受容体間相互作用のインビトロ評価系ついて、培養細胞を用いた系の最適化を進めると共に、精製タンパク質などを用いたセルフリー系の構築を進める。項目【2】について、引き続き、野生型及び変異型PXR及び転写共役因子など発現コンストラクトなどを組み合わせ、モデル遺伝子のレポーター解析に取り組むと共に、ヒトPXR安定発現細胞株を用いて、内在性の標的遺伝子の調節機序の解析を実施する。
次年度使用額が生じた理由	（理由）本年度は、項目【1】について、レポーター解析を軸に解析を進め、また、化学物質のCAR及びPXR反応性のインビトロ評価系構築に取り組んだ。また、本研究課題の目的達成に向けて、実施期間延長を申請したことから予定額と実支出額に差異が生じた。（使用計画）本研究計画及び推進方策に沿いながら、研究費を研究遂行に使用する。その内訳として、今年度に引き続き、レポーター解析やタンパク質の発現・精製、タンパク質間相互作用解析に必要な試薬類や消耗品の購入を中心に、また、得られた本研究の成果を学会及び学術雑誌において発表する為に使用する。