| 研究課題/領域番号 |
19K07055
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| 研究機関 | 京都薬科大学 |
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研究代表者 |
中山 祐治 京都薬科大学, 薬学部, 教授 (10280918)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | チロシンキナーゼ / 細胞分裂 / EphA2 |
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| 研究実績の概要 |
(計画1)EphA2のキナーゼ活性が細胞分裂制御に必要なのか既にAsp739Asn変異を導入し検討したが、さらに、Lys646Met変異体を作成した。まず、DNA塩基配列解析により変異導入を確認した。この変異体は自己リン酸化であるTyr588のリン酸化を示さず、さらに、in vitroキナーゼアッセイにおいて、添加したATPに依存してHAタグを融合した野生型EphA2が自己リン酸化したのに対し、Lys646Metでは自己リン酸化が検出されなかった。これらの結果から、キナーゼ活性不活化変異体であることを確認した。オープンリーディングフレーム外の配列を標的としたsiRNAを用いて内在性EphA2をノックダウンすると、これまで観察していた細胞分裂遅延が観察されたが、このキナーゼ活性不活化変異体を発現させると、内在性EphA2のノックダウン による細胞分裂遅延が解除された。以上より、EphA2による細胞分裂制御に、EphA2のキナーゼ活性は必要ではないことを明らかにした。
(計画2)予備的検討ではあるが、内在性のEphA2のノックダウンにより細胞質分裂異常を示した細胞が増加した。
(計画3)受容体型チロシンキナーゼであるALKをsiRNAおよび阻害剤により阻害すると、細胞分裂異常が観察された。
(計画4)v-Srcによるチロシンリン酸化シグナリングの破綻が、tetraploidチェックポイントの中心的なキナーゼであるLATS2へ与える影響を調べた結果、v-SrcによるLATS2の直接的なリン酸化によりLATS2のキナーゼ活性が抑制されることを見出した。このLATS2のキナーゼ活性の抑制は、共役転写因子YAPによるLATS2の発現レベル上昇をもたらし、v-Srcにより誘導されるブレブ形成を抑制した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
コロナ禍において、大学院生および学部生の大学への入構が長期にわたり禁止された。入構制限が解除された後も、入構する学生の人数、時間、が制限された。このような状況下においても、多くの実験結果が得られてはいるが、多少の遅れは否めない。
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| 今後の研究の推進方策 |
2020年度の結果を受け、次のように進めていく。
(計画1)EphA2による細胞分裂制御にはEphA2のSer897のリン酸化が必要であるが、リン酸化されたEphA2がどこに局在するのか、証明できていない。内在性のEphA2の発現レベルでは、リン酸化特異抗体による検出は不可能であったため、EphA2過剰発現細胞を用い、リン酸化Ser897の細胞内局在を検討する。また、リン酸化EphA2に結合するEphxin4にHAタグ、あるいはEGFPを融合し、細胞に発現させてその局在を解析する。結果によっては、Ephexin4の一部を用い検討する。CDK1、EMK/ERK、RSKの阻害剤を用い、リン酸化Ser897のシグナルが特異的に検出できているか確認する。
(計画2)βカテニンを共染色して二核細胞を判断し、EphA2の細胞質分裂における役割を解析する。予備的な検討結果は得られているが、他の標的配列のsiRNA、異なる細胞種などを用い検討する。
(計画3)IGF1Rの阻害をAuroraB阻害と併用すると、強い増殖阻害効果を示したため、その機構について調べる。
(計画4)v-Srcの細胞分裂への影響として、AuroraBの局在異常を報告したが、その機構は不明である。そこで、Aurora Bの活性への影響に着目し解析する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
コロナ禍において、大学院生、学部生の大学への入構が制限され、使用が減った。さらに、現存の器具や試薬を利用したことで、次年度使用額が生じた。最終年度は、論文投稿、英文校正、などを含め執行する。
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