| 研究課題/領域番号 |
19K07078
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| 研究機関 | 北海道医療大学 |
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研究代表者 |
中川 宏治 北海道医療大学, 薬学部, 教授 (80360949)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | PIAS1 / HIF-1 / 低酸素応答 / 転写制御 / SUMO化修飾 / がん悪性化 |
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| 研究実績の概要 |
1)PIAS1とHIF-1αの結合性の解析および結合領域の同定：低酸素条件（1%O2）で培養したU2OS細胞の抽出液を用いて、免疫沈降およびウェスタンブロット解析を行った結果、PIAS1とHIF-1αの共沈が観察され、細胞内在性のPIAS1とHIF-1αが生理的条件下でも結合することが確認された。また、293T細胞に、FLAG-tagを付加した野生型HIF-1αもしくは3種類のHIF-1α欠失変異体（1-310 aa変異体、311-603 aa変異体および604-826 aa変異体）をMyc-tagを付加したPIAS1と共に過剰発現させ、免疫沈降およびウェスタンブロット解析を行った結果、HIF-1αタンパク質のN末端側の1-310 aa領域、および、中央部分311-603 aa領域がPIAS1との結合に関与することが判明した。
2)PIAS1によるHIF-1依存的な転写活性増強機構の解析：293T細胞に、野生型PIAS1もしくはW372A変異体（RING finger-likeドメインの変異体）の発現ベクターをHIF-1応答性のHREレポーター遺伝子と共に導入した後、低酸素下（1% O2）で培養してHREレポーター活性を測定した。その結果、PIAS1 W372A変異体では、野生型PIAS1と比較して、HREレポーター活性に対する増強作用の著しい減弱が観察され、PIAS1によるHIF-1依存的な転写活性の増強にはRING finger-likeドメインが必要であることが判明した。
3)PIAS1欠損細胞の作製：低酸素応答におけるPIAS1の細胞生物学的意義を解析する目的で、Crispr/Cas９システムを用いたゲノム編集により、PIAS1遺伝子を欠損する293細胞の作製を行い、欠損細胞のクローンを得た。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
がん細胞の悪性化におけるPIAS1の機能解析に用いるPIAS1遺伝子欠損HeLa細胞の作製が完了していないため、以降の研究計画にやや遅れが生じている。
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| 今後の研究の推進方策 |
現在までの結果を踏まえて以下の解析を行う
1) PIAS1のRING finger-likeドメイン依存的なHIF-1の転写活性増強機構の解析
① PIAS1による転写共役因子のリクルート機構の解析、②PIAS1によるSUMO化修飾の促進がHIF-1αの転写活性に及ぼす影響の解析
2) 低酸素応答制御におけるPIAS1の細胞生物学的・腫瘍生物学役割の解析
①ゲノム編集によるPIAS1遺伝子欠損HeLa細胞の作製、②血管新生因子発現への影響の解析、③細胞の運動性・浸潤性に対する影響の解析、④抗がん剤感受性に対する影響の解析
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