| 研究課題/領域番号 |
19K07088
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| 研究機関 | 帝京大学 |
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研究代表者 |
山下 純 帝京大学, 薬学部, 教授 (80230415)
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| 研究分担者 |
松本 直樹 帝京大学, 薬学部, 助教 (40447834)
佐々木 洋子 帝京大学, 薬学部, 講師 (90324110)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | リン脂質 / ホスホリパーゼ / リゾリン脂質 / ホスファチジン酸 / リゾホスファチジン酸 / リゾホスファチジルイノシトール / ホスファチジルイノシトール / DDHD1 |
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| 研究実績の概要 |
私たちは新規カンナビノイド受容体GPR55のアゴニスト・リゾホスファチジルイノシトール（LPI）、特にsn-2アシル型のLPI、すなわち2-アラキドノイルLPIの生理機能や産生機序を解析している。LPI産生の鍵酵素のひとつとして細胞内ホスホリパーゼA1 DDHD1を同定した。DDHD1はホスファチジン酸（PA）を基質として好むホスホリパーゼA1（PA-PLA1）として報告されたが、私たちはこの酵素がホスファチジルイノシトール（PI）も基質とし、2-アラキドノイルLPIを産生することを酵素レベルと細胞レベルで示した。DDHD1の性状解析を行う過程で、DDHD1の遺伝子変異が神経変性病の遺伝性痙性対麻痺（hereditary spastic paraplegia）を引き起こすことを発見した。
これまでにDDHD1遺伝子の変異や過剰発現が、細胞のミトコンドリア呼吸に影響を与え、細胞の増殖や生存に影響を与えることを見出した。特にDDHD1遺伝子の過剰発現ががん細胞のワールブルグ効果を解除することを見出し、メカニズムの解明は抗がん作用に応用できると考えられる。ワールブルグ効果はがん細胞に特徴的な代謝変換で、ミトコンドリア呼吸を制限して解糖系により必要なエネルギーを産生することが知られている。また、ミトコンドリア呼吸を制限することが、がん細胞が不利な条件で生き延びることにつながることが想定されているからである。
しかし、DDHD1の活性調節機構は明らかになっていない。遺伝子欠損や過剰発現など病的な状態だけでなく、通常の状態でもDDHD1な何らかの生理的な調節がなされているはずである。本研究ではDDHD1の活性調節の探索の過程で、DDHD1がリン酸化されることを見出し、リン酸化サイトやリン酸化に関わるプロテインキナーゼを同定した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
DDHD1ホスホリパーゼA1の活性調節機構を探索する目的で、FLAG-DDHD1を発現させたHEK293細胞を用いて、リン酸化の状態を Phos-tag SDS-PAGEと抗FLAG抗体を用いたWestern Blottingにより解析した。Phos-tagはリン酸基を特異的に捕捉する物質で、それをアクリルアミドゲルに結合させたPhos-tag SDS-PAGEは、リン酸化されたタンパク質の移動度が低下することで、タンパク質のリン酸化状態を検出できる。
細胞抽出液をラムダファージのホスファターゼで処理すると、処理しないものと比較してPhos-tag SDS-PAGEでの移動度が上昇した。すなわち、DDHD1はリン酸化されており、ホスファターゼの処理により脱リン酸化されたことを示していた。一方、細胞をプロテインホスファターゼの阻害剤のオカダ酸で処理すると、FLAG-DDHD1の移動度が顕著に低下するバンドが観察された。この結果はプロテインホスファターゼの阻害により、FLAG-DDHD1が過剰にリン酸化されたこと、複数のリン酸化部位を持つことを示している。
DDHD1の一次構造をもとに、リン酸化されるセリン残基トレオニン残基や関与するプロテインキナーゼを、リン酸化予測プログラムを用いて検索した。予想通り複数のリン酸化アミノ酸残基が予測された。
予想されたリン酸化部位（セリン残基）を、アラニンに置き換えた変異体を発現させて、Phos-tag SDS-PAGEの移動度を検討した。セリン残基のアラニンへ置換により、移動度が上昇することから、置換したセリン残基がリン酸化されることが確かめられた。
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| 今後の研究の推進方策 |
DDHD1の生理的な意義を検討する。特にリン酸化がどのような影響を及ぼすかを詳細に検討する。予備実験において、DDHD1のリン酸化によりホスホリパーゼA1活性がそれほど大きく変化しないことを見出している。DDHD1は複数のアミノ酸残基がリン酸化されるので、リン酸化の影響を正確に理解することは難しい。そこでリン酸化を模倣するとされるグルタミン酸の導入置換実験を行った。リン酸化されうるセリン残基をアラニンまたはグルタミン酸残基に置換した変異体を発現させ、リン酸化を受けない変異体とリン酸化を模倣する変異体とした。それぞれ精製酵素のホスホリパーゼA1活性を予備的に検討すると、リン酸化を受けない変異体（アラニン置換）の酵素活性は、アミノ酸置換しないものと比べ、活性に変化は無かった。一方、リン酸化模倣DDHD1（グルタミン酸置換）のホスホリパーゼA1活性は、アミノ酸置換しないものと比べ、若干の活性低下が見られた（最大２０％程度の活性低下）。これらの予備研究の結果は、DDHD1のリン酸化はホスホリパーゼA1活性を大きくは変化させないことを示している。今後の研究で、リン酸化の生理的な意義を詳しく検討する予定である。また、リン酸化の変異体を用い、発現細胞のミトコンドリア呼吸能や細胞増殖、生存を変化させるかどうかを検討する。
これらの研究はDDHD1の生理的な機能の解明につながることが考えられる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究計画に若干の変化があったが、進行に大きな変化はない。
使用しなかった研究費を最終年度に併せて使用する。
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