| 研究課題/領域番号 |
19K07142
|
|---|
| 研究機関 | 星薬科大学 |
|---|
研究代表者 |
奥 輝明 星薬科大学, 薬学部, 講師 (20409361)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
|
| キーワード | マスト細胞 / アレルギー / スーパー抗原様タンパク質 / SSL / 黄色ブドウ球菌 / Coronin-1 / アクチン結合タンパク質 |
|---|
| 研究実績の概要 |
本研究は、黄色ブドウ球菌由来タンパク質Staphylococcal superantigen-like proteins （SSLs）や宿主マスト細胞に発現するアクチン結合タンパク質Coronin-1に注目し、アレルギー応答におけるマスト細胞の機能制御機構の解明を目指している。SSLsには14種類のファミリータンパク質が知られているが、予試験の結果よりSSL11の解析を中心とした。
これまでにマウス骨髄由来マスト細胞（BMMC）へのSSL11の前処理により、抗原刺激依存的なβ-hexosamindiaseの産生（脱顆粒）が抑制されることを明らかにしている。そこで、大腸菌にて発現させ精製したHisタグ融合型SSL11（His-SSL11）のマスト細胞への結合性について解析を行った。その結果、BMMCやMC/9（マウスマスト細胞株）、RBL-2H3（ラットマスト様細胞）へのHis-SSL11の結合が認められた。また、この結合はGST融合型SSL11（GST-SSL11）によって阻害されることが示された。一方、His-SSL7のマスト細胞への結合性は認められなかった。GST-SSL11を用いてRBL-2H3細胞溶解液よりプルダウンアッセイおよびSDS-PAGEを行った。その結果、約85 kDaにSSL11結合タンパク質と推測されるバンドが検出された。
マスト細胞への抗原抗体複合体刺激によってERK1/2やLyn、p38MAPK、Akt、JNKなどの細胞内情報伝達分子のリン酸化が起こることが知られているが、これらの分子のリン酸化に先立ってCoronin-1のSer-412のリン酸化が起ることを明らかにした。現在、Coronin-1のリン酸化とこれら分子のリン酸化との関係性解析するために、CRISPR/Cas9システムを利用したリン酸化部位変異体発現細胞の樹立を行っている。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
初年度に予定していたSSL11に対するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製も行い、ウエスタンブロットおよび免疫沈降に利用できる抗体を得ている。また、他のSSLファミリータンパク質の発現ベクターの作製も概ね完了した。CRISPR/Cas9システムによるCoronin-1遺伝子の変異体作製では、リン酸化部位への変異体が導入できることがPCR法により確認された。
|
| 今後の研究の推進方策 |
マスト細胞とSSL11の結合に関する分子の解明やSSL11の結合領域を明らかにし、マスト細胞の刺激応答を制御できるか解析する。また、SSL11の機能的最小領域における細胞毒性や機能障害性の解析を行う。一方で、Coronin-1のリン酸の意義を明らかにし、マスト細胞の活性化に必須の現象であるか、また制御することが可能であるか検討する。リン酸化部位の変異体Coronin-1発現細胞を樹立し、機能解析を行うことが必要であると考えられた。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
（理由）
購入予定であった消耗品の国内在庫がなく、生産が年度内に満たされなかったために未使用金が生じた。
（使用計画）
現在、消耗品の生産・輸入が完了したため、予定通りに進められる。
|
