| 研究課題/領域番号 |
19K07174
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| 研究機関 | 東京薬科大学 |
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研究代表者 |
高橋 葉子 (遠藤葉子) 東京薬科大学, 薬学部, 助教 (30453806)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | ナノバブル / 多糖類コーティング / ミキシング / miRNA |
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| 研究実績の概要 |
本課題では、核酸搭載、サイズ制御、ペプチド修飾の技術を融合した新規ナノバブル（超音波造影ガス封入リポソーム）の開発、および脳梗塞治療への応用を目指している。前年度までに、生体内で安定なアニオン性ナノバブル表面への核酸搭載技術として、多糖類コーティングの有用性を示し、それに適した脂質組成の検討を行った。当該年度は、最適化した脂質組成のアニオン性ナノバブルを用い、核酸搭載に伴う血清存在下でのmiRNA安定性評価、ペプチド修飾による標的指向性の付与を試みた。その結果、ナノバブル表面に搭載させたmiRNAは、50%血清存在下においても、miRNA単独と比較して安定性が向上することが明らかとなった。また、超音波造影ガス封入前のアニオン性リポソームに対し、Angiopep-2ペプチド修飾を行い、脳血管内皮細胞に対する相互作用性について、コントロールペプチド（Angiopep-7）修飾リポソームとの比較検討をしたところ、ペプチド配列特異的な相互作用が得られる修飾条件が示唆された。現在は、造影ガスを封入しバブル化した際の標的指向性について評価を進めている。さらに、高速攪拌（ミキシング）によるナノバブルのサイズ制御にも着手したところ、30秒のミキシングにより、ナノバブルの均一性の向上と平均粒子径の減少が認められた。その際、個数濃度の増大も認められ、それに伴い、ナノバブルの振動・圧縮（キャビテーション）誘導に適した条件が変わることも明らかとした。キャビテーション誘導は、核酸の細胞内導入において駆動力となることから、今回得られたミキシングナノバブルにおける導入条件は、核酸導入に伴う治療効果を目指す本課題において重要な情報である。また、ミキシングナノバブルにおいても、多糖類コーティング、miRNA搭載が可能であることも示し、その至適条件を見出した。現在、細胞内核酸導入効果の評価を進めている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当該年度前半はコロナ禍での規制もあり、計画としてはやや遅れているといえる。前年度の核酸搭載に続き、本課題の基盤技術となるミキシングによるサイズ制御に成功し、その際における多糖類コーティングについての至適条件を明らかとした。サイズ制御と核酸搭載の両者の技術を適用したナノバブルの検討には着手できたものの、ペプチド修飾に関しては、超音波造影ガス封入前のリポソームでの検討にとどまり、ナノバブルでの評価には至っていない。また、in vivoでの評価も進められていないことから、やや遅れていると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
核酸を搭載させたミキシングナノバブルによる細胞内導入効果の評価を進め、さらに、ミキシングの有無によるin vivoでの組織深部への到達性への影響について、超音波造影および蛍光イメージング等により評価する。ミキシングナノバブルの脳内における到達領域や導入エリアが示された後、それに適した標的細胞（血管内皮細胞、神経細胞等）への指向性付与が可能なペプチドを選択し、表面修飾を試みる。ナノバブルの標的細胞に対する特異性について、フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡、蛍光イメージング等により評価を行い、それらを指標に修飾条件の最適化を目指す。また、マウス脳への核酸導入効果の評価を進め、モデルマウスにおける治療効果の検討へと繋げていく予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
2020年度未使用による次年度使用額が一部あるものの、in vivo実験が少なかったことが影響していると考えられ、動物への投与が増えるにつれ、使用するペプチド・脂質・miRNA量も増えると考えられる。2021年度請求額と合わせ、脳梗塞モデル構築のための各種実験器具・試薬、ペプチド修飾リポソーム調製のための数種のペプチド・脂質、合成miRNA、動物、解析用の各種試薬など、主に物品購入に使用する予定である。
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