| 研究課題/領域番号 |
19K07201
|
|---|
| 研究機関 | 埼玉医科大学 |
|---|
研究代表者 |
川野 雅章 埼玉医科大学, 医学部, 准教授 (30447528)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
|
| キーワード | simian virus 40 / virus-like particle / immune response / innate immunity / adaptive immunity / cytotoxic T lymphocyte / antibody production / vaccine |
|---|
| 研究実績の概要 |
サルのポリオーマウイルスであるsimian virus 40 (SV40) は、直径50 nm程度の正二十面体構造のウイルス粒子の内部に2本鎖環状DNAをゲノムとして内包している。SV40ウイルス粒子の特徴は、VP1と呼ばれるたんぱく質1種類のみで粒子を構築していることであり、しかもその構築には宿主細胞性因子は必要無く、VP1の自己集合化と呼ばれる機能によって自発的に行われる。この機能を利用して、我々は、バキュロウイルス昆虫細胞発現系を用いて、SV40 VP1のみから構成される中身が中空のウイルス様粒子 (VLP, virus-like particle) を大量に調製できる方法を開発した。さらに、このVLPの内部に外来のタンパク質を内包する方法も開発した。これらの方法を利用して我々は、外来抗原を内包したSV40 VLPを構築し、SV40 VLPに対する獲得免疫応答を利用することで、内包した外来抗原に対して細胞傷害性T細胞 (CTL, cytotoxic T lymphocyte)、および、抗体産生を誘導する新規のVLPワクチンの開発を行っている。我々の体内には、ウイルス侵入を認識して免疫応答する機能が備わっているが、SV40 VLPに対する免疫応答はほとんど明らかになっていない。これまでの我々の解析によって、外来抗原を内包したSV40 VLPを免疫賦活剤 (アジュバント, adjuvant) を加えることなくモデルマウスに免疫すると、内包した外来抗原に対してCTL、および、抗体産生が誘導されることが明らかになっている。我々はこれらの免疫誘導機構を詳細に解析することを本研究の目的とし、SV40 VLPは確かにヘルパーT細胞に対して獲得免疫を誘導できること、および、SV40 VLPを作用させたB細胞からSV40 VLPに対する抗体産生を誘導するために必要な因子の同定を行った。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
SV40 VLPに内包した外来抗原に対してどの免疫細胞がどのような機構でCTLの誘導や抗体産生を誘導するのかは不明であった。本年度において、我々は、SV40 VLPによるヘルパーT細胞分化誘導メカニズムの解析、および、SV40 VLPによるB細胞抗体産生誘導メカニズムの解析を計画した。実際、我々は、マウスリンパ球よりナイーブCD4陽性T細胞を単離し、SV40 VLPと共に1週間培養した後、1型ヘルパーT細胞、2型ヘルパーT細胞、17型ヘルパーT細胞、濾胞性T細胞、制御性T細胞の各マーカーで染色し、マーカーの上昇するヘルパーT細胞を解析した。その結果、特定のマーカーの上昇が確認された。このことから、SV40 VLPは確かにヘルパーT細胞に対して獲得免疫を誘導できることが示唆された。また、マウスリンパ球よりB細胞を単離し、SV40 VLPと共に24時間培養すると、B細胞において、免疫活性化マーカーが上昇すると共に、特定のケモカインの産生が確認された。加えて、B細胞において、特定のcluster of differentiationマーカーの上昇も確認できた。さらに、B細胞とSV40 VLPを反応させて24時間培養した後、SV40 VLP反応B細胞をマウス腹腔に戻し、その1週間後にマウスから血清を回収することで、血清中にSV40 VLPに対する抗体産生を誘導する系の構築を行った。この構築した系を用いてSV40 VLPを作用させたB細胞からSV40 VLPに対する抗体産生を誘導するために必要な因子の同定を行った。よって、本研究計画年度の、SV40 VLPによるヘルパーT細胞分化誘導解析、および、SV40 VLPが作用したB細胞からのSV40 VLPに対する抗体産生誘導解析は、予定通りに遂行することができたため、現在までの進捗状況としては、おおむね順調に進展していると考える。
|
| 今後の研究の推進方策 |
今後の研究の推進方策としては、予定通りSV40 VLPによる細胞性免疫活性化機構の解析をおこなう予定である。そのために、マウスから、マクロファージ、および、natural killer細胞を調製し、SV40 VLPと反応させた後、免疫活性化マーカーの上昇とサイトカイン、および、ケモカインの産生の誘導を解析することで、これらの細胞が活性化していることを確認する。また、マウスリンパ球よりCD8陽性T細胞を単離し、SV40 VLPと24時間反応させた後、免疫活性化マーカーの上昇とケモカイン産生の誘導を解析する。さらに、IFN-γ、IL-2、および、granzyme Bの産生量の解析を行う。これらの指標の上昇を確認することでCD8陽性T細胞が活性化することを確認する予定である。さらに、B細胞とSV40 VLPを反応させて24時間培養した後、SV40 VLP反応B細胞をマウス腹腔に戻し、その1週間後にマウス脾臓からリンパ球を回収し、再びSV40 VLPを作用させることで、SV40 VLPに対して細胞傷害活性を有するCD8陽性T細胞を誘導する系の構築を行いたい。この系を構築するための指標としては、SV40 VLP特異的に産生されると予想されるIFN-γ、IL-2、および、granzyme Bの産生量をELISA法で解析する予定である。これらの産生量の上昇を元にして系の構築を行う。そして、この構築した系を用いてSV40 VLPを作用させたB細胞から細胞傷害性T細胞 (CTL, cytotoxic T lymphocyte) に対して細胞傷害活性を誘導するために必要な因子の同定を行う予定である。必要な因子の同定、最も高い細胞傷害活性を誘導するための条件を決定した後、実際にSV40 VLP依存的なCTLによる細胞傷害活性をchrome release assayなどにより解析する予定である。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
本研究計画年度に解析を予定した、マウスリンパ球よりナイーブCD4陽性T細胞を単離し、SV40 VLPと共に1週間培養した後、1型ヘルパーT細胞、2型ヘルパーT細胞、17型ヘルパーT細胞、濾胞性T細胞、制御性T細胞の各マーカーで染色した後、各ヘルパーT細胞マーカーの発現上昇の解析、および、マウスリンパ球よりB細胞を単離し、SV40 VLPと共に24時間培養した後、免疫活性化マーカーの発現上昇、および、特定のcluster of differentiationマーカーの発現上昇の解析、特定のケモカインの産生のELISAによる解析、B細胞において、特定のcluster of differentiationマーカーの発現上昇の解析、さらに、B細胞とSV40 VLPを反応させて24時間培養した後、SV40 VLP反応B細胞をマウス腹腔に戻し、その1週間後にマウスから血清を回収することで、血清中にSV40 VLPに対する抗体産生を誘導する系の構築を行った。これらの解析において、当初予定したよりも少ない予備実験回数で、本実験を行うことができたため、次年度使用額が生じた。使用計画としては、今後の推進方策におけるSV40 VLPを作用させたCD8陽性T細胞より産生されるIFN-γ、IL-2、および、granzyme Bの産生量をELISA法で解析する際の試薬代として使用する予定である。
|
