| 研究課題/領域番号 |
19K07248
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| 研究機関 | 香川大学 |
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研究代表者 |
川合 克久 香川大学, 医学部, 助教 (80534510)
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| 研究分担者 |
荒木 伸一 香川大学, 医学部, 教授 (10202748)
江上 洋平 香川大学, 医学部, 講師 (80432780)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | マクロピノサイトーシス / RabGTPase / 小胞輸送 |
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| 研究実績の概要 |
本研究の解析対象であるマクロパイノサイトーシス様の新規輸送経路は次の特徴を示す。（１）取り込みの初期の段階でマクロパイノソーム様の構造から長い管状構造を形成する。（２）マクロパイノソーム様の構造のカップが閉じずに消滅する。これまでに我々は、マクロパイノソーム様構造および出芽した管状構造にはRab10が強く局在することを見出している。様々な受容体および接着分子の可視化プローブ(GFP-TLR, GFP-cadherin, GFP-PD-L1, GFP-integrinなど)を用意し、RAW264細胞においてRab10陽性新規輸送経路によって運ばれるかどうかを検討した。その結果、GFP-PD-L1がRab10陽性のカップおよびチューブ構造に局在することを見出した。さらに、抗PD-L1抗体を用い可視化した内在性PD-L1もRab10陽性のカップおよびチューブ構造に局在が見られた。
一般的にRabタンパク質の局在は、C末端側の脂質修飾領域近傍が決定している。これまでの研究成果により、Rab10のカップおよびチューブ構造への局在は、Rab10のN末端側が担っていることが明らかとなっている。Rab10の局在決定機構の解析を進めるため、Rab10およびRab10近縁のRabタンパク質の入れ替えキメラ変異体を作製した。複数のキメラ変異体の局在解析により、Rab10のC末端側の脂質修飾領域近傍は小胞体への局在を担っていることが示された。これらの結果は、Rab10が２ケ所の領域でそれぞれ別々の膜(カップおよび小胞体)に標的する可能性を示唆している。今後、キメラ変異体を利用し、Rab10陽性新規輸送経路におけるRab10の役割を小胞体への標的化の観点から解明する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
これまで多くの膜タンパク質プローブを用い、Rab10陽性新規輸送経路によって運ばれるターゲットを解析してきたが、特異的にこの輸送経路で運ばれるものは見いだせていなかった。しかしながら、本年度は、Rab10陽性新規輸送経路で積極的に運ばれる分子として、PD-L1を同定することができた。PD-L1のRab10陽性新規輸送経路への局在は、GFP融合PD-L1および抗PD-L1抗体による免疫染色の両方において確認できた。これまでにRab10の細胞内局在は、GFPおよびmCherryなどの蛍光タンパク質融合変異体の発現により解析を行っていた。本年度の研究成果として、内在性Rab10の抗体染色により、内在性Rab10がカップおよびチューブ構造に局在することを見出した。さらに、Rab10のリン酸化状態をモニターできる抗リン酸化Rab10抗体の利用も含め、今後、内在性Rab10の細胞内分布の解析も進めていく。本年度までにRab10の局在化の解析ツールとなる様々なRab10キメラ変異体の作製を終えている。次年度は、これらのキメラ変異体を用い、Rab10が示すN末端側およびC末端側の２ケ所の局在決定の意義について解析を進める。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度は、Rab10陽性新規輸送経路により運ばれるものとして膜タンパク質であるPD-L1を見出した。次年度は、PD-L1がRab10陽性新規輸送経路に特異的に輸送される機構を明らかにする。他の受容体および接着分子などで、Rab10陽性新規輸送経路で運ばれないものと比較することで、PD-L1を積極的に運ぶための分子基盤を解明する。Rab10をモニターするツールとして抗Rab10抗体および抗リン酸化Rab10抗体の両方を用い、新規輸送経路におけるRab10の局在状態およびRab10のリン酸化状態を比較することでRab10のリン酸化による制御について考える。近年、パーキンソン病の原因分子であるLRRK2がRab10をリン酸化することが報告されており、Rab10のリン酸化状態と細胞内輸送機構の制御は大変興味深いところである。昨年度までに準備しているRab10キメラ変異体を用いRab10の局在解析を進める。Rab10に特徴的な２ケ所の局在決定の意義について明らかにすることを目的とする。Rab10には様々なエフェクター分子が報告されている。Rab10の局在決定にはこれらのエフェクター分子に加え、Rab10の活性化因子であるRabGEFあるいは抑制制御因子であるRabGAPなどのRab10制御因子の関与も考えられる。これまでに、これらの分子の解析ツールも用意しており、Rab10キメラ変異体に加え、これらのRab10関連分子の解析により、Rab10の局在機構およびRab10陽性新規輸送機構の役割の解明に取り組む。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
おおむね予定していた使用額であり、次年度使用額は少額のため、大幅な使用計画の変更は必要なく培養関係の消耗品に充てる。
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