研究課題
哺乳類の減数分裂に必須なタンパク質であるHORMAD1やその近縁分子で減数分裂チェックポイントに必要なHORMAD2は複数のリン酸化修飾を受けることが知られているが、各リン酸化の機能的意義はほとんど明らかにされていない。HORMAD2のＣ末端付近には３ヶ所のリン酸化部位(Ser284/287/288)が存在する。そのうち１ヶ所のリン酸化部位(Ser284)について、以前の解析でゲノム編集により非リン酸化型(Ala284)とリン酸化模倣型(Asp284)に改変したマウスを作製して表現型解析を行い、非リン酸化型HORMAD2マウスの卵巣では卵母細胞の細胞死がやや亢進し、逆にリン酸化模倣型HORMAD2マウスの卵巣では対合不全による細胞死が部分的に抑制される、という結果を得ていた。今年度は前年度に作製した、マウスHORMAD2のC末端付近の３ヶ所のリン酸化部位(Ser284/287/288)全てを非リン酸化型(Ala284/287/288)とリン酸化模倣型(Asp284/287/288)に改変したマウスの表現型解析を行った。これまでのところ、Ser284のみの変異体と3ヶ所全ての変異体とでは、対合不全の多寡などの条件の違いにより、その表現型が一致しないという解析結果が出ており、単純に非リン酸化型であれば細胞死が亢進し、逆にリン酸化型であれば細胞死が抑制される、というものではないとも考えられる。今後の方針としては、さまざまな条件下での各変異体の挙動について、特に核内ドメインや染色体軸への局在を詳細に解析し、各変異体による細胞死誘導活性と核内での分子挙動との関係を理解することにより、一見矛盾した結果を統一的に理解できるような知見を得たいと考えている。
3: やや遅れている
HORMAD2の３ヶ所のリン酸化部位について、非リン酸化型とリン酸化模倣型に改変したマウスの表現型解析が行えたことは、当初の想定以上の成果である。一方、その結果が単純には理解できないようなものであった点や、当初計画していたHORMAD2の2種類のリン酸化状態それぞれに特異的なモノクローナル抗体の作製、細胞死誘導の分子機構の解析については遅れが生じている。従って、全体としてはやや遅れた進行状況になっている考えている。
HORMAD２のリン酸化状態と細胞死誘導活性が単純には対応しないと思われるため、各変異体の細胞内局在について、詳細に解析し直す必要があると考えている。具体的には、一部の変異体で、ある核内ドメインへの局在傾向に違いが見られたため、その局在のしやすさと細胞死誘導活性の間の関係を検討したいと考えている。また、野性型で実際に存在するマウスHORMAD2の２種類のリン酸化状態についても同様の解析を行うため、特異的なモノクローナル抗体を作製して、免疫組織染色による形態学的解析を進める。同時に、非リン酸化型とリン酸化模倣型の変異体と結合するタンパク質（複合体）を免疫沈降法などにより同定をすることで、HORMAD２のリン酸化の機能的意義の解析を進めていきたい。
タンパク質複合体の質量分析や、モノクローナル抗体の作製に着手できていないため、次年度使用額が生じたと考えている。次年度には、いずれにも着手したいと考えている。
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Genome Biology
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Molecular Neurobiology
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10.1007/s12035-020-02057-3
http://anatcb.dept.med.gunma-u.ac.jp/
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