| 研究課題/領域番号 |
19K07264
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| 研究機関 | 福井大学 |
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研究代表者 |
黒田 一樹 福井大学, 学術研究院医学系部門, 准教授 (60557966)
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| 研究分担者 |
深澤 有吾 福井大学, 学術研究院医学系部門, 教授 (60343745)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | AMPA型グルタミン受容体 / SDS処理凍結割断レプリカ標識 / 膜分子複合体 / サブユニット構成 / 局在解析 / 電子顕微鏡 |
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| 研究実績の概要 |
脳内の速い興奮性シナプス応答を担うAMPA型グルタミン酸受容体(AMPAR)は、4つのサブユニットで構成された膜分子複合体で、構成するサブユニットの種類(1-4)の違いにより、その応答特性やシナプス可塑性における役割が異なることが報告されている。しかし、サブユニット構成の異なるそれぞれのAMPARが、機能的に区画化された神経細胞の細胞膜上にどの様に分布して機能を支えているかについては、複合体のサブユニット構成を1分子レベルで調べる方法が無いため不明である。
そこで本申請課題では、膜分子の分布を高い空間分解能と感度で可視化できるSDS処理凍結割断レプリカ標識法(SDS-FRL法)を改良して、神経細胞膜上に発現するAMPARのサブユニット構成を同定し、サブユニット構成の異なるAMPARの膜上分布を明らかにすることを目的としている。
本年度は、培養細胞を用いてSDS-FRL法において効率よく検出が可能なことが明らかとなったエピトープタグ(E-tag)をCRISPR/Cas9法によりGluA1 (GRIA1)及びGluA2 (GRIA2)遺伝子に導入を行い、E-tagが導入されたGluA2マウスの作成を行った。一方、E-tag-GluA1マウスの作成に関しては、導入したE-tagがGluA1の機能に影響を与えるのかマウスが作成が出来ず、GluA1の機能またはマウスの生存に影響を与え無い新たなE-tagの検索を行い、E-tag-GluA1マウスの作成を継続している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
SDS-FRL法で使用可能な複数のE-tagとE-tag抗体の組み合わせは培養細胞系で見出しており、CRISPR/Cas9法によりGluA1 (GRIA1)及びGluA2 (GRIA2)遺伝子に選定したE-tagの導入を行い、GluA2にE-tagが導入されたマウスの作成を完了している。本研究の一つの目的であるGluA2を含むAMPARの検出は、E-tag-GluA2マウスの完成によりその解析基盤が整った。今後はE-tag-GluA2マウスを繁殖させ、SDS-FRL法により解析を行う。一方、GluA1に関しては、GluA1の機能やマウスの生存に影響を与えないと予想される新たなE-tagの検索は完了しており、CRISPR/Cas9法によりE-tag-GluA1マウスの作成を進め、SDS-FRL法を用いた分子局在解析を行う
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| 今後の研究の推進方策 |
E-tag-GluA2マウスの作成を済んでおり、本研究の一つの目標である神経細胞に発現するGluA2を含むAMPARをSDS-FRL法により検出を行い、分子局在解析を行う。一方、GluA1に関しては、GluA1の機能やマウスの生存に影響を与えないと予想される新たなE-tagの検索は完了しており、CRISPR/Cas9法によりE-tag-GluA1マウスの作成を行い、神経細胞に発現するGluA1の分子局在解析を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
SDS-FRL法では特殊な銅製のキャリア(金属部品)を使用し、サンプルを超高圧超低温状態でサンプルを凍結させ、特殊な装置を用いてレプリカ膜の作成を行っている。この銅製のキャリアは専門の業者に特別注文で作成を依頼し、また材料費は約10万円、キャリアの作成費として約30万円の計40万円が必要となる。令和2年度中に専門の業者に依頼したが、業者の都合により納品が令和3年度となった。その為、令和2年度の使用計画と使用額との間に約40万円の差が生じた次第です。
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