| 研究課題/領域番号 |
19K07264
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| 研究機関 | 福井大学 |
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研究代表者 |
黒田 一樹 福井大学, 学術研究院医学系部門, 准教授 (60557966)
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| 研究分担者 |
深澤 有吾 福井大学, 学術研究院医学系部門, 教授 (60343745)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | AMPA型グルタミン酸受容体 / SDS処理凍結割断レプリカ標識 / 膜分子複合体 / サブユニット構成 / 局在解析 / 電子顕微鏡 |
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| 研究実績の概要 |
脳内の速い興奮性シナプス応答を担うAMPA型グルタミン酸受容体(AMPAR)は、4つのサブユニットで構成された膜分子複合体で、構成するサブユニットの種類(1-4)の違いにより、その応答特性やシナプス可塑性における役割が異なることが報告されている。しかし、サブユニット構成の異なるそれぞれのAMPARが、機能的に区画化された神経細胞の細胞膜上にどの様に分布して機能を支えているかについては、複合体のサブユニット構成を1分子レベルで調べる方法が無いため不明である。
そこで本研究では、膜分子の分布を高い空間分解能と感度で可視化できるSDS処理凍結割断レプリカ標識法(SDS-FRL法)を改良して、神経細胞膜上に発現するAMPARのサブニット構成を同定し、サブユニット構成の異なるAMPARの膜上分布を明らかにすることを目的としている。
培養細胞を用いてSDS-FRL法により効率よく検出可能なエピトープタグのスクリーニングを行い、CRISPR/Cas9法により2xHA tagをGluA2(GRIA2)遺伝子に導入したマウスを作成した。この2xHA-GluA2マウスより脳組織を回収し、SDS-FRL法により脳内の神経細胞におけるGluA2を含むAMPARの検出を抗HA抗体を用いて行った。しかし他のエピトープタグと同様に、抗エピトープタグ抗体によってGluA2を含むAMPARの検出は出来なかった。通常の間接蛍光抗体染色では抗エピトープタグ抗体により神経細胞に発現するGluA2の検出は出来ており、実験条件の変更や抗原賦活化等により解析を進めた。これらの改善により、SDS-FRL法により抗HA抗体を用いて神経細胞に発現するGluA2を含むAMPARの検出が可能となり、シナプス後のPSDにおけるAMPARの局在解析をサブユニット構成に基づき解析することが可能となった。
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