2019 年度実施状況報告書

交感神経に随伴するシュワン前駆細胞の他種細胞分化の検証とその分子基盤

研究課題

研究課題/領域番号	19K07267
研究機関	神戸大学
研究代表者	伊藤圭祐神戸大学, 医学研究科, 助教 (10575468)
研究期間 (年度)	2019-04-01 – 2022-03-31
キーワード	シュワン前駆細胞 / 自律神経系 / Phox2b / Notch / 交感神経系 / Phox2b 3'UTR / bipotential progenitor
研究実績の概要	申請者は今年度、計画書に記載したPhox2b-Creノックインマウスの作成に成功し、このマウスの肢芽内にPhox2b-Cre陽性細胞がどの程度存在するのかを、レポーターマウスであるRosa-lox-stop-lox-tdTomato (Ai9)と掛け合わせ、解析した。その結果極めて多くのtdTomato陽性細胞が肢芽内に存在することが明らかになり、交感神経ニューロンを形成する神経堤細胞由来のbipotential progenitorが、肢芽内に移動して局在する可能性が示唆された。実際これらtdTomato陽性細胞は肢芽内の神経線維に随伴し、シュワン前駆細胞（SCP）マーカーであるSox10を発現し、一部はPhox2Bタンパク質を発現していた。申請者はまた、肢芽内の全てのPhox2B陽性細胞が、神経線維に随伴して存在することも免疫染色で確認した。このことから、Phox2B陽性細胞はbipotential progenitorを経たSCPに由来する可能性が高いことが明らかになったまた申請者はPhox2b遺伝子のレポーターマウスであるPhox2b-LacZマウスを導入し、様々な変異マウスとの掛け合わせを行って、肢芽内に存在するLacZ陽性細胞の数の変化に着目した。我々はまず神経分化に必須のシグナル伝達経路としてNotch signalingに着目し、Notchの下流で働く転写因子、Rbpjコンディショナルノックアウトマウスの表現型を解析したが、肢芽内のLacZ陽性細胞の数に変化はなかった。またPhox2b mRNAの3’ UTRにおいてmiRNA結合部位として機能し、Phox2Bの発現を調節する配列を欠損したマウスを作成したものの、LacZ陽性細胞の数に変化はなかった。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由今年度の計画として、我々はPhox2b-Creノックインマウスを作成し、Phox2B発現履歴を持つ、神経線維に随伴した細胞の局在パターンを計画したが、計画通りの実験が遂行できた。またPhox2B発現履歴を持つ細胞が実際に多数肢芽内に存在することも確認した。このことから、肢芽内には交感ニューロンを形成する神経堤細胞由来のbipotential progenitorが神経に沿って移動する、あるいはSCPに一旦分化して肢芽内に進入し、一部がそこでPhox2B陽性細胞に分化する可能性が示唆された。今後Phox2b-CreERT2マウスも使用し、Phox2B陽性細胞の分布について解析していく。また申請者は今年度、様々な変異マウスにおいて肢芽内のPhox2B陽性細胞の分布・局在に変化がないか解析する実験も並行して行うことができた。いまだ何らかの異常を示す変異マウスの同定には至っていないものの、さらに多くの変異マウスとの掛け合わせを進めていく。
今後の研究の推進方策	今後は計画書に記載通り、さらなる変異マウスとの掛け合わせを進め、Phox2B陽性細胞の肢芽内における異常を示すマウスの同定を目指す。現在申請者が所属する研究室で維持しているSox10およびArteminノックアウトマウスのほか、神経芽腫モデルマウスであるTh-MycNトランスジェニックマウスとの掛け合わせを進めており、2020年度中の解析が可能な状況にある。また肢芽内のSCPにおける遺伝子発現プロファイリング解析のため、今後FACSソーティングの系を立ち上げる。Phox2b-LacZマウスを用い、肢芽組織を分散し、βgal抗体でインキュベートしてFACSソーティングを行う。高頻度に認められる遺伝子についてはゲノム編集により遺伝子破壊マウスを作成する。また最近、ニワトリ胚脊髄神経節ニューロンにおいて、Sox10の発現によりユビキチンリガーゼが上昇し、神経系譜の転写因子・Neurog2の分解が促進されるという論文が発表されている。このためユビキチンリガーゼのシグナル経路についても着目していきたい。