| 研究課題/領域番号 |
19K07272
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| 研究機関 | 岩手医科大学 |
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研究代表者 |
東尾 浩典 岩手医科大学, 教養教育センター, 講師 (50342837)
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| 研究分担者 |
齋野 朝幸 岩手医科大学, 医学部, 教授 (40305991)
横山 拓矢 岩手医科大学, 医学部, 講師 (70772094)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 細胞生物学 / マスト細胞 / 脱顆粒 / エキソサイトーシス |
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| 研究実績の概要 |
マスト細胞は分泌顆粒に様々な生理活性物質を貯留しており、分泌刺激を受けるとそれらを開口放出する。この調節性分泌を脱顆粒という。本研究では4D（XYZ軸＋時間軸）イメージングにより、マスト細胞の脱顆粒様式の実態解明に取り組んでいる。
4Dイメージングには、独自に構築した、分泌顆粒の局在・挙動の可視化（mCherryによる）と脱顆粒の可視化（pH感受性GFPバリアントpHluorinによる）を同時に可能とする脱顆粒インジケーター、およびiRFPベースの細胞膜マーカーを用いている。昨年度までに、1) 分泌顆粒は大きく動的なクラスターを形成し、クラスター間に一過的な接着やtubule構造の形成を介した連絡があること、2) TPA+A23187刺激時にはクラスター内／間での逐次的な脱顆粒（compound exocytosis）が顕著であること、3) 抗原刺激時には分泌顆粒がクラスターから細胞辺縁へ移動して脱顆粒すること、および4) 脱顆粒インジケーターが分泌刺激依存的に（脱顆粒の検出を問わずに）細胞外へ放出されることを見出してきた。
今年度は2)～4)の詳細な解析を行った。4)においては新たに、TPA+A23187刺激時には細胞表層の激しい変形による細胞膜脱離が起こり、その直下のクラスターから生じた分泌顆粒が積み込まれて放出されること、また抗原刺激時には分泌顆粒が入り込んだ微細突起が細胞辺縁で生じ、それがちぎれて浮遊することを示唆する結果を得た。浮遊物のサイズからもエクソソームである可能性は小さく、分泌顆粒を積み荷とする新規のマイクロベシクルである可能性が考えられた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
本研究は、予備実験・条件検討を研究代表者の所属機関にて行い、研究協力者の所属機関（理化学研究所・和光本所）にて超解像共焦点ライブイメージング顕微鏡(SCLIM)を用いた4Dライブイメージングを行うことを前提に計画していた。しかしこれまで、新型コロナウイルス感染拡大状況を鑑みながらの出張となり（予定回数の半分）、データ取りが遅延している。幸い昨年度途中に所属研究機関の共焦点レーザー顕微鏡が更新され4Dライブイメージングが可能となったが、当該顕微鏡でのイメージング条件の設定に時間を費やしてしまい、結局今年度は当初計画の半分以下の進捗状況となった。
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| 今後の研究の推進方策 |
TPA+A23187刺激時は主にクラスター内／間で逐次的に脱顆粒する。一方、抗原刺激時はクラスターの弛緩によって生じた分泌顆粒が細胞辺縁へ移動し開口放出する。それぞれの脱顆粒様式を司る分子群（遺伝子群）を細胞骨格系・小胞輸送系に焦点を絞って同定し、鍵となる分子基盤の差異とともに両様式の違いを提示する。加えて、ライブイメージング中に見出された構造物を電子顕微鏡観察でも捉え、その微細構造を明らかにする。
別途、分泌顆粒を積み荷とするマイクロベシクル放出の可能性についても検討を進める。まず、脱顆粒インジケーターを含む細胞外小胞がエクソソームであるかマイクロベシクルであるかを、小胞を分離後に形態学的に（電子顕微鏡観察などで）・生化学的に（ウエスタンブロットなどで）・生理学的に（脱顆粒インジケーターの蛍光を指標とするFACSなどで）解析することで同定する。マイクロベシクルである場合は新規性が高いと想定されるため、小胞形成過程を詳細にライブイメージングし、その分子基盤を細胞膜形態形成に働く分子群（遺伝子群）にも着目して明らかにする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
一昨年度からの度重なる研究出張の中止により、約3回分の旅費相当額および出張先での実験に必要な試薬器具代などが次年度へ繰り越しとなった。 昨年度の条件設定を通じて、研究代表者の所属研究期間でも一定程度まで4Dイメージングを行えるようになったため、残額の大半は所属研究機関における実験に係る費用（例：細胞骨格阻害剤／細胞骨格マーカータンパク質／遺伝子ノックダウン／FACS用抗体／電子顕微鏡観察試料作成などに係る費用）に充当される見込みである。
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