| 研究課題/領域番号 |
19K07273
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| 研究機関 | 自治医科大学 |
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研究代表者 |
佐藤 滋 自治医科大学, 医学部, 准教授 (70306108)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 内耳 / 有毛細胞 / 難聴 / 転写制御 / ホメオボックス遺伝子 / 感覚器プラコード |
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| 研究実績の概要 |
胎生17.5日マウス胚から単離した蝸牛有毛細胞のATAC-seq解析により、Six1遺伝子のTAD（topologically associating domain）内に7ヶ所のオープンクロマチン領域を同定した。これら7ヶ所の配列はSix1の有毛細胞特異的エンハンサーの候補である。今年度は、最もピーク値が高いATAC1配列を欠損するマウスの作製を試みた。ATAC1はSix1エクソン周辺の非コード配列中で最も保存性の高い耳プラコード/嗅上皮/上鰓神経節/脳下垂体前葉/唾液腺エンハンサー（Six1-21エンハンサー）を含んでおり、その欠失はSix1の発現レベル低下を引き起こし、内耳有毛細胞もしくはより早期の耳胞のパターニングに影響を及ぼす可能性も考えられた。
Six1エキソンの3'側に位置するATAC1配列を含む約1.5 kbを欠失させるために2種類のgRNAをデザインし、エレクトロポレーションにより受精卵に導入した。生まれたマウスの中の1個体でPCRと配列解析によりATAC1の欠失を確認することができた。このマウスをΔATAC1ファウンダーマウスとし、野生型マウスとの交配によるバッククロスを開始した（以上、理研BRC天野孝紀先生との共同研究）。ΔATAC1ヘテロ個体同士の交配により得られた仔マウスの遺伝子型を調べたところ、ホモ個体が複数含まれていた。以上より、ATAC1の欠失でSix1の発現レベルが全体として低下し、Six1欠損マウスのように致死になることはないということがわかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
E17.5マウス蝸牛有毛細胞のATAC-seq解析で同定したオープンクロマチン領域（エンハンサー候補）について、Tgマウスを用いたレポーター解析ではなく、蝸牛外植片への遺伝子導入を行う。他機関との調整は不要であり、同定したエンハンサーの重要配列のマッピングの際も有用な技術であるため、蝸牛培養の経験のある複数の研究者の協力を得て解析を迅速に進める。
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| 今後の研究の推進方策 |
ΔATAC1ホモ個体の行動や聴力の検査は重量であり、今年度行う。また、ΔATAC1マウスの解析と同時並行で、ATAC1とATAC2（Six1-12耳胞/上鰓神経節/脳下垂体前葉エンハンサー）の両方を欠失するマウスをゲノム編集法にて作製し、解析を開始する。マウス個体におけるSix1の発現に及ぼすエンハンサー候補配列の役割が明確になる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
今年度は組換えマウス個体を使った実験に集中したため、蝸牛の培養は次年度行うこととした。次年度使用となった予算は、蝸牛培養用の器具、試薬、動物の購入に使用する。
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