環境ストレス適応の基盤となる細胞時計の同期振動を駆動する蛋白質コード

2019 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 19K07288
• 研究機関: 東邦大学
• 研究代表者: 田丸 輝也 東邦大学, 医学部, 講師 (80291706)
• 研究期間 (年度): 2019-04-01 – 2022-03-31
• キーワード: circadian rhythm / stress response / transcription factor / transcription factor / Bioluminescence / protein modification / nuclear translocation / phosphorylation

研究実績の概要

環境によるストレス(環境ストレス)は様々な健康問題・疾患(生活習慣病・癌等)を引き起こし、時計蛋白質BMAL1等による細胞時計を介するストレス適応能の低下はその一因だと考えられている。研究代表者はその根拠として、様々な環境ストレス(熱、活性酸素、UV)に対し、複数の適応防護システムと連携した細胞時計の同期応答が適応反応を駆動し、その同期障害はストレス適応能を低下させることを示している。
本研究は、環境ストレス適応の基盤となる細胞時計の同期を統御する蛋白質コード（修飾、相互作用、細胞内局在等）を解明することを目的とする。研究代表者はその鍵として細胞時計同期の初期過程で、不可欠な役割を担うBMAL1のS領域(BMAL1-S)とBMAL1核局在の同期（ISR）を発見し、同期に関与しうるBMAL1蛋白質制御も解明している。
本年度は、末梢時計モデルとして、繊維芽細胞の単一細胞レベルで、多様な環境・ストレスによる細胞時計同期において、１）時計遺伝子発現発光レポータを指標に、BMAL1-S が必須であることを示した。２）BMAL1の免疫染色により、時計同期の初期の ISR現象を確認し、ISRにBMAL1-S が必須であることを示した。中枢時計における解析の準備段階として、SCN特異的BMAL1KOマウスを交配により作製するとともに、AAVベクターにおけるレスキュー系を確立した。本研究で示される新たな時計同期機序の知見を礎に、ストレス適応能の向上を図る医療への展開が期待される。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

本研究の標的である環境ストレス適応の基盤となる細胞時計の同期を統御する蛋白質コードを解明する鍵として、時計繊維芽細胞の単一細胞レベルで、多様な環境・ストレスによる細胞時計同期を発光を利用した生細胞リアルタイム測定、免疫染色などで探った結果、１）時計遺伝子発現レポータのリズムを指標に、BMAL1-S が時計同期に必須であることを示した。２）BMAL1の核・細胞質への分布動態を調べることにより、時計同期の初期の ISR現象を確認し、ISRにBMAL1-S が必須であることも示した。当初、計画していたテーマのうち、中枢時計すなわち、脳、視床下部のSCNにおける上記の解析は、SCN特異的なBMAL1ノックアウトマウスの交配による作製が完成に近づいたが、未完であり、AAVベクターでBMAL1を発現し、時計機能をレスキューする系を確認するのは末梢時計で確立したが、中枢時計では、まだ、実施していない。また、BMAL1-Sに結合する蛋白質のMS解析は、内在性レベルの発現量では、十分な収量を得られていないため、他の実験を優先した。

今後の研究の推進方策

これまでに以下の研究については目覚しい成果を挙げた、今後、１）SCN特異的なBMAL1ノックアウトマウスの交配による作製とBMAL1発現によるレスキューする系で、中枢時計における細胞時計同期におけるBMAL1-S の役割の解明。　２）ISRを生細胞リアルタイムで測定するため、GFPopt-BMAL1の発現によるBMAL1の挙動の生細胞リアルタイム蛍光コンフォーカル解析を進めていきたい。３）BMAL1-Sに結合する蛋白質のMS解析は、タグを改良して、精製純度を上げることを検討している。

次年度使用額が生じた理由

中枢時計すなわち、脳のSCNスライス培養とマウス個体行動の解析は、SCN特異的なBMAL1ノックアウトマウスの交配による作製が完成に近づいたが、未完であり、中枢時計では、まだ、実施していない。その為、動物実験、スライス培養実験に関わる費用が抑えられ、次年度使用額が生じた。次年度は、繰越分とあわせて、主に、動物実験、スライス培養実験のための試薬、受託合成・解析費、また、論文投稿学会参加費などに使用する予定である。

研究成果

• [雑誌論文] Cell-based screen identifies a new potent and highly selective CK2 inhibitor for modulation of circadian rhythms and cancer cell growth (2019)
  • 著者名/発表者名: Oshima T, Niwa Y, Kuwata K, Srivastava A, Hyoda T, Tsuchiya Y, Kumagai M, Tsuyuguchi M, Tamaru T, Sugiyama A, Ono N, Zolboot N, Aikawa Y, Oishi S, Nonami A, Arai F, Hagihara S, Yamaguchi J, Tama F, Kunisaki Y, Yagita K, Ikeda M, Kinoshita T, Kay SA, Itami K, Hirota T
  • 雑誌名: Science Advances 巻: 5 ページ: eaau9060
  • DOI: 10.1126/sciadv.aau9060
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] The clock components Period2, Cryptochrome1a, and Cryptochrome2a function in establishing light-dependent behavioral rhythms and/or total activity levels in zebrafish (2019)
  • 著者名/発表者名: Hirayama Jun、Alifu Yikelamu、Hamabe Rin、Yamaguchi Sho、Tomita Jun、Maruyama Yusuke、Asaoka Yoichi、Nakahama Ken-ichi、Tamaru Teruya、Takamatsu Ken、Takamatsu Nobuhiko、Hattori Atsuhiko、Nishina Sachiko、Azuma Noriyuki、Kawahara Atsuo、Kume Kazuhiko、Nishina Hiroshi
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 9 ページ: 196
  • DOI: 10.1038/s41598-018-37879-8
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [学会発表] Initial protein events commonly pivotal for various environments/stresses- triggered cellular clock synchronization. (2019)
  • 著者名/発表者名: Teruya Tamaru, Genki Kawamura, Hikari Yoshitane, Takeaki Ozawa, Yoshitaka Fukada, Ken Takamatsu
  • 学会等名: EBRS2019 (XVI EUROPEAN BIOLOGICAL RHYTHMS SOCIETY CONGRESS)
  • 国際学会
• [学会発表] Circadian BMAL1-HSF1-;p53 interplay regulates UV-triggered clock synchronization to evoke stress protection. (2019)
  • 著者名/発表者名: Genki Kawamura, Teruya Tamaru, Mitsuru Hattori, Ken Takamatsu, Takeaki Ozawa
  • 学会等名: EBRS2019 (XVI EUROPEAN BIOLOGICAL RHYTHMS SOCIETY CONGRESS)
  • 国際学会
• [学会発表] Initial signals to synchronize cellular clocks commonly evoking environmental stress adaptation. (2019)
  • 著者名/発表者名: 田丸輝也, 吉種 光, 河村玄気, 小澤岳昌, 深田吉孝, 高松研
  • 学会等名: 第 26 回日本時間生物学会学術大会