| 研究課題/領域番号 |
19K07305
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| 研究機関 | 埼玉医科大学 |
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研究代表者 |
三輪 尚史 埼玉医科大学, 医学部, 教授 (40255427)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 受精 / 卵保護膜 |
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| 研究実績の概要 |
令和2年度において、ダイカルシンによる卵周囲構造制御メカニズムを解析することを目的とし、下記の成果を得た。
１.ダイカルシンの卵周囲構造に及ぼす影響を解析するために、卵周囲構造の糖鎖分布の変化をレクチンの染色性により解析したところ、ダイカルシン過剰存在下および欠損マウスのWGAレクチン及びRCA-Iレクチンの染色性に、今のところ顕著な違いは認められてはいない。解像度を高めることを含めさらに詳細な観察を実施する予定である。
２.ダイカルシンの標的分子を同定するために、初代培養された卵丘細胞から水溶性および膜画分を調製し、二次元電気泳動後メンブレンに転写し、蛍光標識ペプチドと反応させたものの、蛍光シグナルが弱いことがわかった。そこで、マウス卵巣腫瘍細胞を利用し、標的分子を含んだ試料の量を増やし、同様の実験を行ったところ、強い蛍光シグナルとなるスポットが分離できた。このスポットについて質量分析を行い、候補分子を推定できた。今後、この分子について同定を試みる。
３.マウスダイカルシンの受精阻害作用の責任領域を同定するために、マウスダイカルシン全長アミノ酸配列を７つの領域に分け、各々の領域に対応するペプチドを合成し、卵・卵丘細胞塊への結合能を解析した。その結果、いくつかのペプチドが結合を示し、その中でも最大の結合能を示す領域を同定した。今後、これらのペプチドの受精阻害作用を解析し、ダイカルシンの受精阻害作用部位を同定することを予定している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初の令和2年度計画は、1.ダイカルシンの卵周囲構造糖鎖分布への影響の解析、2.ダイカルシンの標的タンパク質の同定、3.ダイカルシンの卵丘細胞膜タンパク質への作用の解析である。1.について、ダイカルシンの卵周囲構造のレクチン染色性に及ぼす影響を解析したところ、今のところ顕著な差を確認できていない。2.については、卵丘細胞の初代培養を利用し、二次元電気泳動により、標的分子の可視化を試みたものの、蛍光シグナルが弱く標的分子の同定は困難であった。そこで、卵巣腫瘍細胞を利用したところ、標的分子を分離することに成功した。今後、標的分子の同定を予定している。また、3.についても、ダイカルシン全長を７つの領域に分割し、各領域のアミノ酸配列に対応する蛍光ペプチドを利用し、卵・卵丘細胞塊への結合能を解析することにより、作用部位領域を推定できた。以上より、研究の進展はおおむね順調と考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
令和2年度に引き続き、ダイカルシンの卵周囲構造に及ぼす影響を解明する。そのために、ダイカルシンの標的分子の同定を進める。また、ダイカルシンの精子膜に及ぼす影響を解析するために、まず、マウス精子のパッチクランプ記録方法を確立する。これまでに、マウス精子膜のパッチクランプ記録の報告は極めて少ないことから、本実験によって得られる成果は、独自性が高く、有意義な結果になる可能性が高いと考えている。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度の支出を適正に行ったことにより、本年度の所要額に比べ、5万円以内の未使用額があった。この未使用分は、次年度に繰り越して使用する予定である。
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