| 研究課題/領域番号 |
19K07306
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| 研究機関 | 東京慈恵会医科大学 |
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研究代表者 |
山澤 徳志子 東京慈恵会医科大学, 医学部, 准教授 (00282616)
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| 研究分担者 |
村山 尚 順天堂大学, 医学部, 准教授 (10230012)
小川 治夫 東京大学, 定量生命科学研究所, 准教授 (40292726)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | リアノジン / カルシウム / 分子動力学計算 |
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| 研究実績の概要 |
筋小胞体膜にあるリアノジン受容体（RyR）は、Ca2+誘発性Ca2+放出（Ca2+-induced Ca2+ release; CICR）の特性を示す巨大なイオンチャネルである。300種類以上の点突然変異が同定されており、CICR活性の変調により筋疾患や心臓疾患を引き起こす。だが、たった1箇所のアミノ酸置換が巨大なイオンチャネル活性を変え疾患を引き起こすメカニズムは不明である。この疑問は科学的興味はもとより、将来の診断・治療へ向けても解決されるべきである。RyR1の変異多発領域は3箇所（領域１；35～614番、領域２；2163～2458番、領域３；3916～4943番）あるが、今年度は領域１（N末端領域；NTD)変異に焦点を絞り、その構造的特徴についての知識を得るために、in silicoで突然変異体の分子構造を構築し、これまでに機能解析をしたMH変異体および野生型（WT）の分子動力学（MD）計算を行った。NTDは3つのサブドメイン（A～C）から構成される。NTDのMD計算の結果、サブドメインの境界に位置し、CICR活性を亢進するR402C変異体は、BCサブドメインが旋回していることが明らかになった。構造変化の原因を追究するため、WTで、NTD内で形成される全てのアミノ酸残基間の相互作用（塩橋/水素結合）を解析した。WTでは、R402を含んだ4種類の塩橋/水素結合ネットワークが形成されていたが、R402C変異体ではR402-D61とR402-E40の塩橋/水素結合が消失したことにより、サブドメイン間の安定性が悪くなり、立体構造が変化したと考えられた。Ca2+応答の異常を構造的特徴と結びつけることに初めて成功した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
MD計算から得られた塩橋/水素結合ネットワークの重要性を検証する実験に取り組み、塩橋/水素結合ネットワークに参与するアミノ酸4種類の変異体遺伝子（E40A, D61A, R283A, S406A）は作製した。予備的に、D61をアラニンに置換したD61A変異体について解析を行い、D61A変異RyR1のMD計算は、R402C変異と同様に、BCサブドメインが旋回することを明らかにした。これより塩橋/水素結合ネットワークの重要性の検証実験の基盤が確立した。
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| 今後の研究の推進方策 |
１、塩橋/水素結合ネットワークに関わる残りアミノ酸残基についても、順次MD計算と生理実験を実施していく。
２、MD計算時間を250ナノ秒まで延長して解析し、分子動力学計算から得られた原子の配置を簡便に可視化できる解析手法を構築する。
３、心臓に発現しているRyR2にも点変異が報告されおり、主にカテコラミン誘発性多形性心室頻拍（CPVT）を引き起こすと示唆されている。RyR2についてRyR1と同じ手法でMD計算を行う。RyR2についても、N末端領域はX線結晶構造が解かれているので、この構造を用いてMD計算を行う。RyR2にもRyR1で見出された塩橋/水素結合ネットワーク形成に関与するアミノ酸残基が保存されていることが一次構造により確かめられてので、これらに人工的変異（アラニン置換）を導入してMD計算を行う予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
3月に注文した物品が、新型コロナウィルスの影響により納期が遅れ4月に納品されたためである。これらの物品は、余裕を持って在庫管理をしているので4月に納品されても研究の遂行に何ら問題はない。
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