| 研究課題/領域番号 |
19K07307
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| 研究機関 | 日本医科大学 |
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研究代表者 |
弓削 進弥 日本医科大学, 先端医学研究所, 助教 (50723532)
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| 研究分担者 |
福原 茂朋 日本医科大学, 大学院医学研究科, 大学院教授 (70332880)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 血管新生 / 創傷治癒 / 皮膚 / ペリサイト / ゼブラフィッシュ / イメージング / 内皮細胞 / 損傷血管 |
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| 研究実績の概要 |
皮膚などの組織では、正常時、末梢血管は、内腔で血管内皮細胞によるシートが形成され、その周囲をペリサイトに被覆されて、安定に維持されている。しかし、創傷などで組織が虚血状態に陥ると、血管新生が誘導され、組織の修復が促され、その過程にペリサイトも関与する。私たちは、独自に開発したゼブラフィッシュ蛍光生体イメージングにより、生きている成魚の皮膚の創傷治癒過程で起こる血管新生でのペリサイトの役割を解明しようと試みてきた。
3年目では、血管とペリサイトを可視化でき、かつペリサイトを選択的に消失できる遺伝子組換え（Tg）ゼブラフィッシュを複数樹立し、それらの魚の正常皮膚・創傷皮膚でペリサイトを消失させた際にどのような変化が起こるかを解析し、さらに正常魚とペリサイトを消失させた魚の両方の皮膚組織から内皮細胞を単離し、ペリサイトが消失した皮膚血管の内皮細胞で遺伝子発現がどのように変化するかをRNAシークエンスによって解析する実験系の確立を試みた。
複数樹立したTg魚どれでも、ペリサイトを消失させると、正常皮膚の血管網には1ヶ月以上顕著な変化は観られなかったが、創傷皮膚では、血管網の再生は起こるが、伸長再生途上の血管が蛇行や湾曲したり、そこからの新たな出芽が起こったりする現象が増加した。したがって、創傷皮膚ではペリサイトが正常な血管新生を促す役割を担うことが示唆された。なお、創傷皮膚での再生血管へのペリサイトの再被覆は、Tg魚によって観えたり観えなかったりしたため、これらに関しては詳細な解析を進行中である。いっぽう、正常皮膚とペリサイト消失皮膚のRNAシークエンスに関しては、皮膚組織からの内皮細胞の単離とRNAの抽出の実験系を確立したところで、これからRNAシークエンスをかけて結果を解析していく。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
全体としては、当初の計画通りに研究が進んでいるが、以下の2点で、進行状況にかなりの遅れが生じている。そのために、科研費使用を1年間延長させていただいた。
本研究の基本となる遺伝子組換え（Tg）ゼブラフィッシュの樹立では困難が続いた。最初に樹立したTg魚では、ペリサイトの可視化がややモザイク状になったために、いくらかの皮膚領域でペリサイトを認識できない・ペリサイトを消失できない問題が生じた。次に樹立したTg魚では、ペリサイト以外の繊維芽細胞のいくらかも可視化されたために、ペリサイトを消失するとそれらの細胞まで消失してしまい皮膚全体がダメージを負ってしまう問題が生じた。ただし、これらのTg魚でも、欠点を踏まえた上で実験に使うことは可能で、実際に実験に使用している。しかし、より万全な解析のために、これらの欠点を克服できるTg魚を現在樹立している。
RNAシークエンスでは、皮膚の内皮細胞の単離で苦戦していた。1匹のTg魚の皮膚から得られる内皮細胞の数が予想よりもはるかに少なかったために、確実に内皮細胞を単離する手法の確立と、正常魚・ペリサイト消失魚それぞれ10匹以上のTg魚を準備することに時間がかかった。また、これらの実験系の確立のために、新しい機器や試薬を導入して試行してみる前実験で、かなりの時間がかかった。
以上の2つの大きな問題に直面して、当初の予定よりもかなりの時間がかかって科研費使用期間も1年延長させていただいたが、それぞれの困難に適切に対処して、全体としては当初の計画通りに研究を進めている。
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| 今後の研究の推進方策 |
4年目では、まず、現在樹立途上の、いくつかの欠点を克服して血管とペリサイトを可視化でき、かつペリサイトを選択的に消失させられるTg魚を用いて、改めてペリサイト消失による正常皮膚・創傷皮膚の血管網の変化を明らかにする。同時に正常皮膚とペリサイト消失皮膚での内皮細胞のRNAシークエンスを行い、ペリサイトが無い時に内皮細胞がどのような遺伝子発現の変化を起こすかを明らかにする。
以上の研究から、創傷皮膚で、ペリサイトが血管新生でどのような役割を担っているかを明らかにしていき、さらに、ペリサイトの有無で内皮細胞がどのような動態を示すかを解明し、本研究を通じて、これまでに分かっていない・予想されていなかったペリサイトの役割と機能を解明する。
さらに、本研究の追加として、申請者の前研究で明らかにした、「創傷皮膚での損傷血管の伸長は、血流によって生じる内腔圧によって抑制される」という現象と制御機構に、ペリサイトが関与しているかどうかも解明していきたい。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究過程で、必要な遺伝子組換え魚の樹立とRNAシークエンス解析実験がかなり遅くなってしまったことが大きな理由である。前者に関しては、元々あまり費用がかからなかったが、この後樹立した魚を用いて行う実験に費用が必要である。後者に関しては、これからRNAシークエンスにかけて結果を解析するため、ある程度の費用が必要になる。したがって、科研費1年間延長、およびそれら2つの実験のために4年目の研究費をある程度確保しておいた。4年目には、樹立した遺伝子組換え魚を用いた実験とRNAシークエンス解析実験の2つに残りの研究費用を用いていく予定である。
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| 備考 |
本研究には、研究協力者で研究室同僚の石井 智裕 助教が大きく貢献した。
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