| 研究課題/領域番号 |
19K07309
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| 研究機関 | 愛知医科大学 |
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研究代表者 |
佐藤 元彦 愛知医科大学, 医学部, 教授 (40292122)
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| 研究分担者 |
山村 彩 愛知医科大学, 医学部, 講師 (40633219)
林 寿来 愛知医科大学, 医学部, 講師 (30533715)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 血管内皮増殖因子受容体 / 血小板由来成長因子受容体 / 細胞内情報伝達 |
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| 研究実績の概要 |
申請者が同定したＧ蛋白活性調節因子（Activator of G-protein signaling 8、AGS8）は血管内皮細胞増殖因子受容体と複合体を形成し血管新生を制御していた。申請者は最近AGS8機能を抑制するAGS8阻害薬Xを同定したが、この化合物の有効性を細胞・生体で検討するために、その基礎検討を行った。また、AGS8が血管内皮細胞増殖因子受容体と同様に他のチロシンキナーゼ受容体を制御する可能性も同時に検討を進めた。
まず、AGS8阻害薬Xの毒性を、培養ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を用いて検討した。遊離LDH測定では1～100 ug/mlの範囲では変化が無く、毒性は高くないものと考えられた。申請者らは、血管内皮細胞のVEGFR2シグナルは、AGS8siRNAにより抑制されることを既に報告しているが、AGS8阻害薬XがAGS8siRNAと同様作用を持つか、HUVECで検討した。すなわち、AGS8阻害薬XがVEGF受容体および下流シグナル分子のリン酸化を抑制するかウェスタンブロットにより検討したところ、AGS8阻害薬Xは濃度依存性にこれらを抑制した。
さらに、AGS8が他の受容体、特に血小板由来成長因子(PDGF)受容体を制御する可能性について検討を進めた。ヒト血管平滑筋細胞のAGS8をsiRNAによりノックダウンし①PDGFRαおよびPDGFRβ受容体のリン酸化、②下流シグナル分子(ERK、p38MAPK、AKT)のリン酸化が抑制されるかウェスタンブロットにより検討した。PDGF刺激によりPDGFRαおよびPDGFRβ受容体と一部下流シグナル分子のリン酸化が促進され、AGS8siRNAはこれを抑制した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
令和元年度に予定したAGS8阻害薬Xの基礎検討では、明確な結果が得られた。すなわち、検討結果はAGS8阻害薬Xの毒性は、培養細胞で検討を進めるに当たって問題にならないことを示していた。また、申請者らはAGS8が血管内皮細胞で血管内皮増殖因子受容体のリン酸化に関与することを報告しているが、AGS8阻害薬XはAGS8siRNAと同様にこれを抑制した。すなわち、AGS8阻害薬Xが細胞内で機能することを示すことができた。他方、AGS8阻害薬X のAGS8-Gβγの結合阻害効果を共発現系を用いて行う実験は諸条件の最適化にさらなる検討が必要であった。
また、AGS8が血管内皮細胞増殖因子受容体以外に他のチロシンキナーゼ受容体を制御する可能性について検討を進めたが、AGS8が血小板由来成長因子(PDGF)受容体を制御することも明らかにすることができ、研究上明らかな進展が見られた。
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| 今後の研究の推進方策 |
１．ヒト血管平滑筋細胞のAGS8ノックダウンによりPDGF受容体と下流分子のリン酸化が抑制されることが明らかになったが、PDGF刺激により引き起こされる①細胞増殖（MTTアッセイ）、②細胞遊走（transwell法）も抑制されるかヒト血管平滑筋細胞で検討する。
２．AGS8阻害薬X のAGS8-Gβγの結合阻害効果については、引き続き検討を行う。実験系の複雑な諸条件により、十分な条件を検討しても安定した結果が得られない場合は中断することも考慮する。
３．ヒト血管平滑筋細胞で、endogenous PDGF受容体と発現させたAGS8の複合体検出を免疫沈降法を用いて試みる。
４．AGS8ノックダウンによるPDGFシグナルの抑制がAGS8阻害薬Xでも得られるか検討する。すなわち、ヒト血管平滑筋細胞にAGS8阻害薬Xを作用させ、PDGF受容体リン酸化、受容体下流シグナル、細胞増殖、遊走の抑制を検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
令和元年度に計画されていた助成金は試薬購入の他、研究推進に必要なパートタイム研究補助員の謝金として使用した。研究補助員の休業のため未執行予算が生じた。次年度の消耗品購入、研究補助員謝金として使用する予定である。
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