| 研究課題/領域番号 |
19K07326
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| 研究機関 | 京都府立医科大学 |
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研究代表者 |
勝山 真人 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (60315934)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 活性酸素 / NADPHオキシダーゼ / 組織線維化 |
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| 研究実績の概要 |
組織線維化は不可逆的な変化であり、根治可能な薬物療法は現在のところ存在しない。NOX4は活性酸素種（ROS）を産生するNADPHオキシダーゼの触媒サブユニットの一分子種であり、NOX4が産生するROSは組織線維化に重要な役割を果たすが、その分子機構は未解明の点が多い。
申請者はヒト肺由来線維芽細胞であるIMR-90細胞において、NOX4に対するRNA干渉により、TGF-β受容体の共役受容体であるエンドグリンの発現が蛋白レベルで減少することを見出した。この減少はバフィロマイシンA1で抑制されたことから、リソソームによる分解を介するものであった。またこの減少はプロテインキナーゼC（PKC）の阻害剤であるGF109203Xやatypical PKC（aPKC）の偽基質配列ペプチドによって抑制された。aPKCのうちIMR-90細胞にはPKCλ/ιのみが発現し、ウエスタンブロットではNOX4に対するRNA干渉によりわずかに高分子側にシフトした。aPKCがセラミドにより活性化されるとの報告があることから、膜からセラミドを切り出す中性スフィンゴミエリナーゼ（nSMase）の阻害剤であるGW4869を用いたところ、NOX4のノックダウンによるエンドグリンの発現低下は抑制された。3種類のnSMaseのうちIMR-90細胞に発現するnSMase3に対するRNA干渉により、NOX4のノックダウンによるエンドグリンの発現低下は抑制された。
以上のことから、NOX4由来ROSがnSMase3の活性抑制、PKCλ/ιの活性抑制を介してエンドグリンを安定化・膜表面での機能的発現を維持し、TGF-βのシグナリングを増強しているものと考えられた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
概要に述べた実験については集中的に実験を行ったため順調に進行したが、計画していた他の実験をあまり進めることができなかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
NOX4由来ROSによるnSMase3の酸化がその活性を抑制し、エンドグリンの機能的発現につながる可能性が考えられる。そこでタグを連結したnSMase3を細胞に発現させ、NOX4に対するRNA干渉によるnSMase3の酸化還元状態の変化を、ウエスタンブロットにより解析する。
一方申請者はNOX4 mRNAより4塩基だけ欠失したスプライスバリアントNOX4A mRNAが肺由来線維芽細胞に発現すること、それを過剰発現させた細胞ではROS産生が亢進することを見出し、NOX4AがNOX4のN末端約50アミノ酸に相当する小さな蛋白であることを示唆する知見を得た。NOX4Aは直接ROSを産生するのではなく、他のROS産生系を亢進、あるいはROS消去系を抑制するものと予想される。そこでNOX4Aの細胞内局在を明らかにするとともに、NOX4Aの発現による遺伝子発現の変化を、Cap Analysis Gene Expression（CAGE）法により網羅的に解析する。さらにHaloTag法を用いてNOX4A と会合する分子を探索し、質量分析により同定する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初計画していた複数の実験のうち、ひとつに集中して取り組んだことにより、他方の実験に用いる予定だった研究試薬類を購入しなかったため。これらの試薬類は今年度購入予定である。
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