| 研究課題/領域番号 |
19K07327
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| 研究機関 | 山陽小野田市立山口東京理科大学 |
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研究代表者 |
牛島 健太郎 山陽小野田市立山口東京理科大学, 薬学部, 教授 (70448843)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 時計遺伝子 / 組織特異性 / がん細胞 |
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| 研究実績の概要 |
2020年度では、昨年度での検討に使用したヒト膵臓がん細胞のうちMIA-PacaII細胞およびBxPC-3細胞を用いて、CRISPR-Cas9システムによるBmal1ノックアウト細胞（安定細胞株）の作製を行った。ガイドRNAあるいはCas9タンパク質の細胞導入効率が芳しくなく、導入方法およびエレクトロポレーションの条件、ガイドRNAの標的領域（Bmal1遺伝子の転写開始点から806番目付近から1044番目付近に変更）およびCas9導入量を都度変更して複数回の条件検討を行った。また、CRISPR-Cas9システムによる細胞株作製と並行して、プラスミドを用いてマイクロRNAを過剰発現させることにより、Bmal1遺伝子の安定ノックダウン細胞の作製も行った。いずれの方法においても、最終の細胞セレクションの段階であり、2021年度はこれら安定細胞株を用いた検討を速やかに開始する。
臓器特異性に関する検討として、ヒト肝臓がん細胞（HepG2細胞）を用いた検討を行った。膵臓がん細胞と同様に、ゲムシタビンを曝露してWST-1アッセイを行い薬物に対する感受性を評価した結果、HepG2細胞のゲムシタビンに対する感受性は膵臓がん細胞よりも低かった。続いてsiRNAを用いてBmal1遺伝子をノックダウンしたところ、HepG2細胞のゲムシタビンに対する感受性が高くなる傾向を認めた。このBmal1ノックダウンの影響は、膵臓がん細胞における影響と反対である。抗腫瘍薬感受性における時計遺伝子Bmal1の影響は、臓器によってことなることが示唆されており、今後はその分子メカニズムの解明を行う。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
COVID-19感染拡大のため、大学での研究活動を自粛せざるを得ない時期があり、培養細胞を用いた実験を継続して実施することが困難であった。そのため、CRISPR-Cas9システムを用いたBmal1ノックアウト細胞作製の取り掛かりが遅れてしまった。
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| 今後の研究の推進方策 |
2020年度に未達成であった、CRISPR-Cas9システムによるBmal1ノックアウト膵臓がん細胞および肝臓がん細胞を速やかに作成する。作製する安定細胞株を用いて、Assay for Transposase-Accessible Chromatin (ATAC)-シーケンス解析を行い、Bmal1欠損によるクロマチン３次元構造への影響が膵臓がんと肝臓がんで異なるか否か明らかにする。このATAC-シーケンス解析において膵臓がん細胞における転写活性化配列を明らかにし、その転写調節配列に作用する転写因子によるクロマチン免疫沈降-シーケンス解析およびパスウェイ解析を行う。これらの解析から、Bmal1欠損により顕著な変化を認める細胞内システムに着目し、膵臓がん細胞に薬物抵抗性を与える責任分子を同定する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
2020年度は、COVID-19感染拡大の影響から研究活動の自粛期間が発生したために、研究活動の断続的中断が生じた。そのため、当初に計画していた検討内容を全て実施することができず、次年度使用額が生じた。2020年度に実施できなかった検討内容は、2021年度での追加検討項目としており、当初の計画に沿って研究経費を使用する。
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