| 研究課題/領域番号 |
19K07348
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
坂元 一真 名古屋大学, 医学系研究科, 准教授 (60612801)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 受容体型チロシンフォスファターゼ / 基質 / 質量分析 / リン酸化 / 脱リン酸化 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、受容体型チロシンフォスファターゼの網羅的な基質同定を試みるものである。特にコンドロイチン硫酸・へパラン硫酸受容体として、中枢神経損傷後の神経軸索再生阻害に関わる受容体型チロシンフォスファターゼであるPTPRσの細胞内基質を網羅的に同定することにより、この病態の理解と克服を目指す。
本年度は研究計画に従い、近位依存性ビオチンラベル法によりPTPRσ相互作用分子の解析を行った。PTPRσの活性ドメインの隣接した部位にビオチンリガーゼを融合させたPTPRσ-BioID2融合タンパク質をHEK293細胞に恒常発現させた細胞株を樹立した。ビオチンを添加した培地で培養すると、細胞内のタンパク質がビオチン化された。これらビオチン化タンパク質はPTPRσ相互作用分子の候補である。ビオチン化タンパク質をストレプトアビジンカラムで精製し、LC-MS/MS解析により、ビオチン化タンパク質の同定を行った。この実験を3回繰り返し、最終的に約100のタンパク質をPTPRσ相互作用分子として同定できた。この約100のタンパク質のリストには、すでに既知のPTPRσ相互作用タンパク質や、研究代表者が以前の研究でPTPRσの基質であると同定したCortactinも含まれていたことから非常に信頼性の高い結果だと考えられた。
これらのうち、生物学的活性から特に重要と思われる10程度のタンパク質を抽出した。今後in vitroあるいは細胞内での直接の相互作用・脱リン酸化反応を確認することにより、PTPRσの基質分子の同定を行っていく。さらにリン酸化特異抗体を作製し、損傷軸索でのリン酸化動態を調べる実験などを行うことにより、その生物学的意義を調べていく。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初計画通りの研究を実施できた。また得られた結果についても信頼性の高いものであると考えられた。
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| 今後の研究の推進方策 |
昨年度の研究で得られた約10の新規PTPRσ基質候補分子について、PTPRσによる脱リン酸化を確認する。候補分子は、神経系において重要な機能を持つリン酸化タンパク質としてすでに知られているもので、過去の文献やリン酸化タンパク質/pathway/疾患データベースを参照し選定した。
PTPRσをHEK293T細胞に発現させ、当該分子のチロシン脱リン酸化を、リン酸化特異抗体あるいはPhostag-PAGEにより評価する。必要があればリン酸化特異抗体を作製する。さらに当該分子のリコンビナントタンパク質を作製・精製し、PTPRσ活性ドメインによる直接の脱リン酸化をin vitroで確認する。さらにIMR-32・SH-SY5Yなど、内在性にPTPRσを発現する細胞においてこれをノックダウンし、候補分子のリン酸化状態を評価して、PTPRσの生理的基質であることを確認する。
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