| 研究課題/領域番号 |
19K07370
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| 研究機関 | 高知大学 |
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研究代表者 |
坂本 修士 高知大学, 教育研究部医療学系基礎医学部門, 准教授 (80397546)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | RNA結合タンパク質 / 骨格筋 / 筋成熟 / 筋分化因子 / miRNA |
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| 研究実績の概要 |
昨年度までの解析により我々は、NF90-NF45 dbTg miceの骨格筋は骨格筋細胞の「細胞融合」のマスター因子であるMyomaker/Myomixerの恒常的発現により、筋萎縮を引き起こす可能性を見出した。
そこで本年度は、NF90-NF45によるMyomaker/Myomixerの発現促進の分子機構の解明に取り組んだ。これまでに、筋分化因子であるMyoD及びMyoGがMyomaker/Myomixerの発現を正に制御することが分かっている。我々はこれまでに、筋芽細胞株においてNF90-NF45の発現を抑制することでMyoGの発現が顕著に低下する一方、MyoDの発現は大きな変化を認めないことを見出した。加えて、dbTg miceの骨格筋を用いてmiRNAの網羅的発現解析を行い、野生型マウスと比較し1/2以下に発現が低下しているmiRNAが39個存在することを見出した。その中のmiR-378a-3pに関しては、MyoG mRNAの3’非翻訳領域 (3’UTR)に2つの結合予測配列が存在することが分かった。加えて、野生型マウスと比較し、dbTg miceの骨格筋においてmiR-378a-3pの発現量は低下し、一方で当該miRNAの初期転写産物(pri-miR-378a-3p)の発現量は上昇していた。このことは、NF90-NF45がpri-miR-378a-3pのプロセッシングを抑制することでmiR-378a-3pの産生を低下させる可能性を示唆している。さらにルシフェラーゼ活性を指標にした解析により、miR-378a-3pはMyoG mRNA 3’UTRを標的にし、その翻訳を抑制する可能性が示唆された。これらの解析結果より、マウス骨格筋の萎縮といった高次生命現象が、lncRNA(pri-miR-378a-3p)蓄積-miRNA(miR-378a-3p)産生低下-mRNA(MyoG mRNA)発現上昇のネットワークによるMyomaker/Myomixerの恒常的発現により引き起こされる可能性が示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
「病態生理現象におけるlncRNA-miRNA-mRNAのクロストーク」の面で、今年度の解析によりpri-miR-378a-3p (lncRNA)-miR-378a-3p (miRNA)-MyoG mRNA (mRNA)の流れが筋萎縮 (高次生命現象) を引き起こす可能性を見出すことができた。この点は一つの成果である。そのため自己評価の区分としては(2)を選択した。
一方で、miRNAの初期転写物(pri-mIRNA)以外のlncRNAが高次生命現象を引き起こす機構については、未解明のままである。
2021年度に高次生命現象に関与するpri-miRNA以外のlncRNAを発見するためには、RNA免疫沈降(RIP)と次世代シークエンサー(NGS)を組み合わせたRIP-seq解析が欠かせない。今年度までに、NF90タンパク質を効率良く免疫沈降できる抗体を見出すことができた。そこで、2021年度は、NF90-NF45 dbTg miceの骨格筋由来の細胞祖抽出を用いて当該抗体による免疫沈降を行い、沈降したRNAを回収する。回収したRNAに関してはNGS解析を実施する。
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| 今後の研究の推進方策 |
NF90-NF45はlncRNAを含むRNA内で形成されるステムループ構造に結合し、様々な機能を発揮する。上記のようにNF90-NF45が過剰発現した遺伝子改変マウス (NF90-NF45 dbTg mice)は筋萎縮を引き起こす。従って、NF90-NF45 dbTg miceの骨格筋萎縮の分子機構を明らかにすることで、本研究課題である「病態生理現象におけるlncRNA-miRNA-mRNAのクロストーク」を見出せるものと考え、解析を進めている。これまでにNF90-NF45がlncRNAの一つであるpri-miRNAのプロセッシングを抑制することで、筋萎縮を引き起こす可能性を見出すことはできた。今後はpri-miRNA以外のlncRNAの作用が筋萎縮を引き起こす可能性を見出すために、NF90-NF45 dbTg miceの骨格筋を試料としたRIP-seqを実施する。当該RIP-seqの解析からもたらされる情報は筋萎縮を引き起こす未知の分子機構の発見に繋がり、「病態生理現象におけるmiRNA-lncRNA-mRNAのクロストークの解明」をさらに推進させるものと考えている。
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